Izolacja i identyfikacja pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae
Obejrzeć i opisać kolonie wybranych pałeczek jelitowych (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica) wyrosłych na pożywkach: MacConkeya, SS, Levina, Endo.
Podłoże MacConkeya - podłoże wybiórczo-różnicujące; służy do izolacji pałeczek Gram-ujemnych z materiałów klinicznych. Jest to podłoże diagnostyczne o słabej wybiórczości. Zawartość soli żółci i fioletu krystalicznego hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, które mają duże wymagania odżywcze. Zawartość laktozy jako jedynego cukru pozwala na odróżnienie pałeczek laktozo-dodatnich od laktozo-ujemnych. W obecności zawartego w podłożu wskaźnika - czerwieni obojętnej, wskutek zależnego od rozkładu laktozy zakwaszenia środowiska, kolonie bakterii rozkładających laktozę zabarwiają się na kolor różowy. Kolonie, które aktywnie rozkładają laktozę (np. Escherichia coli), są ponadto otoczone różową strefa wytrąconych soli kwasów żółciowych. Pałeczki laktozo-ujemne (np. Shigella sp.; Salmonella sp.; Pseudomonas sp.;) mają bezbarwne kolonie.
Podłoże Salmonella - Shigella (SS) - Nieliczne E. coli, które rosną na tym podłożu, tworzą kolonie czerwone, otoczone strefą wytrąconego dezoksycholanu sodowego. Większość rodzajów nie rośnie na tym podłożu. Natomiast pałeczki Salmonella rosną dobrze, tworząc kolonie przejrzyste, bezbarwne, gładkie z czarnymi środkami. Kolonie pałeczek Shigella są przejrzyste, bezbarwne.
Podłoże Levina - pałeczki rozkładające laktozę (E. coli, Citrobacter) rosną w postaci ciemnoczerwonych kolonii z odcieniem metalicznym, a pozostałe wykazujące tę zdolność, tj. Klebsiella i Enterobacter tworzą kolonie śluzowe z fioletowymi środkami i różowymi brzegami. Pałeczki nie rozkładające laktozy (Salmonella, Shigella) rosną w postaci kolonii o odcieniu podłoża lub kolonie są szare, zwykle z ciemniejszym środkiem (Hafnia, Serratia). Drobnoustroje Gram dodatnie nie rosną na podłożu Levina.
Podłoże Endo - jest używane w mikrobiologii klinicznej w celu izolowania i różnicowania Enterobacteriaceae. Selektywność podłoża Endo wynika z zawartości połączenia siarczanu (IV) sodu i fuksyny zasadowej, które powoduje częściowe zahamowanie wzrostu drobnoustrojów Gram-dodatnich. Pałeczki jelitowe fermentują laktozę, tworząc kolonie o barwie ciemnoróżowej do różowoczerwonej z opalizującym, złoto - zielonkawym, metalicznym połyskiem i podobne zabarwienie podłoża. Kolonie drobnoustrojów, które nie fermentują laktozy, są bezbarwne do bladoróżowych na jasnoróżowym podłożu.
Wykonać test na wytwarzanie indolu, przez wybrane pałeczki jelitowe.
Wytwarzanie indolu
Woda peptonowa z tryptofanem to podłoże płynne, które służy do oznaczania zdolności wytwarzania indolu. Indol, oprócz skatolu (metylowa pochodna indolu), kwasu pirogronowego i NH3, jest produktem rozkładu tryptofanu przez tryptofanazę. Jego powstanie wykrywa się metodą Kovasca przez nawarstwienie na hodowli odczynnika Ehrlicha. Powstały pierścień w obecności indolu powinien przybrać kolor ciemnoróżowy.
Określić typ fermentacji (odczyn MR) u wybranych pałeczek jelitowych.
Określenie typu fermentacji - odczyn MR
Pałeczki jelitowe mogą przeprowadzać tzw. kwaśną fermentację (charakterystyczną m. in. dla E. coli), czyli z cukrów wytwarzać kwasy: mrówkowy, octowy, mlekowy, bursztynowy oraz alkohol etylowy, w wyniku czego pH hodowli jest niższe od 4,5. Dodana do podłoża czerwień metylowa zmienia zabarwienie z żółtego na czerwone - dodatni odczyn MR. Żółte zabarwienie hodowli po dodaniu czerwieni metylowej świadczy o drugim typie fermentacji, podczas której w przewadze powstają produkty obojętne, np. glikol butylenowy (charakterystyczne dla Enterobacter), w tym przypadku pH hodowli jest wyższe od 4,5. Do określania MR używa się podłoża Clarka.
Dokonać obserwacji zmian na podłożach: Kliglera, Simmonsa z cytrynianem, Christensena (podłoże z mocznikiem).
Wzrost pałeczek na podłożu Kliglera
Podłoże służy do badania zdolności fermentowania laktozy, glukozy, z wytworzeniem lub nie, gazu oraz wydzielania siarkowodoru. Dolna część pożywki w probówce jest w formie słupka (sprawdzamy rozkład glukozy), górna w formie skosu (sprawdzamy rozkład laktozy). Po posianiu do jednej i drugiej części badanego drobnoustroju i 24 godzinnej inkubacji można zaobserwować:
Niezmieniona barwa podłoża (czerwona) - brak rozkładu glukozy i laktozy,
Zażółcenie całego podłoża - rozkład glukozy i laktozy,
Żółty słupek, czerwony skos - rozkład glukozy, brak rozkładu laktozy
Wytwarzanie H2S - zaczernienie podłoża
Wytwarzanie gazu podczas fermentacji - porozrywane podłoże przez pęcherzyki gazu.
W pierwszych godzinach hodowli drobnoustroje wykorzystują glukozę, zakwaszając pożywkę - słupek przyjmuje barwę żółtą. Jeśli bakterie mogą fermentować laktozę, wykorzystują ją w następnej kolejności - skos przyjmuje barwę żółtą. Powstały w hodowli H2S reaguje z jonami Fe2+, powstaje siarczek żelaza, który zaczernia podłoże.
Wytwarzanie ureazy - hydroliza mocznika (podłoże Christensena)
Pałeczki wytwarzające enzym ureazę, hydrolizują mocznik do NH3 i CO2. W wyniku alkalizacji hodowli czerwień fenolowa będąca w podłożu, zmienia zabarwienie z żółtego na czerwone. Badanie przeprowadza się na podłożu z mocznikiem, opisanym przez Christensena.
Wzrost na podłożu Simmonsa z cytrynianem
Cytrynian sodowy jest jedynym źródłem węgla w tym podłożu, a diwodorofosforan amonowy źródłem azotu. Drobnoustroje, które nie potrafią wykorzystywać cytrynianu jako źródła węgla (E. coli, Shigella, niektóre szczepy Proteus), nie rosną na tym podłożu. Drobnoustroje rozkładające cytrynian rosną (pałeczki z rodzaju Salmonella) i zmieniają zabarwienie podłoża (wytwarzanie amoniaku z fosforanu amonowego powoduje alkalizację środowiska) z zielonego na niebieskie. Wskaźnikiem w tym podłożu jest błękit bromotymolowy.
Ocenić zdolność do fermentacji laktozy w podłożu płynnym (z 10% laktozą).
Podłoże z 10% laktozą
To fioletowopurpurowa (purpura bromokrezolowa) pożywka płynna pokryta warstwą oleju parafinowego. Pozwala na szybkie określenie zdolności fermentowania laktozy. Bakterie posiadają zdolność fermentowania laktozy, jeśli podłoże zmienia barwę na żółtą.
Ocenić zdolność redukcji azotanów do azotynów (bulion z 0,1% dodatkiem KNO3).
1 probówka - Po inkubacji do podłoża dodajemy odczynnik Griessa. Powstanie czerwonego zabarwienia w ciągu kilku minut świadczy o wyniku dodatnim.
2 probówka - Obecność NH3 wykrywa się za pomocą odczynnika Nesslera, który po dodaniu do probówki powoduje zmianę barwy na żółtopomarańczową, co świadczy o wyniku dodatnim.
Wykonać test na wytwarzanie katalazy przez bakterie E. coli, P. vulgaris, S. enteritidis, Y. enterocoliticas.
Katalazę wykrywamy, nanosząc na 24 godzinną hodowlę bakterii 3% roztwór wody utlenionej. Pojawiające się na powierzchni podłoża pęcherzyki gazu (tlen) świadczą o wyniku dodatnim.