oczyszczanie białek
Do serparacji cząstek wykorzystuje się różnice w ich wielkości masie ładunku elektrycznym i powinowactwei do innych cząstekczek
im czystrzy enzym błonowy tym mniej przyjazne źródowisko dla niego
uszkodzenie komórek i tkanek i odddzieleniu bałek rozpuszczanych
kilka tysięcy obrotów (rpm) przez 10 20 min pozwala na usyskanie frakcji cytozowlowej
otrzymany upsernantan służy do uzyskania baiłka używa się: wytrącanie solami nieorganicznymi rozpuszczalnikami organicznymi lub przy pomocy podwyższonej temperatury. Jeśli kilka rodzajó to wiruje się w gradięcei sacharozy
Dializa pozbawia białka substrancji droboczsteczkowych stosowanych na różnch etapach oczyszczania. Stosowenie tu półprzepuszczalne płony mają pory wystearczające duże żeby mogły przez nie wchodzić małe czasteczki Białka inne duże cząstki pozostają w worku dializacyjnym. Takie membrany stosuje się zarówno przy oczyszczznu jak i zatężniu białek
Dializuje się w worku. Należy zostawić 1/3 część wolną
metody chromatograficzne
Pomysł Cwiet od 1908 profesor Politechniki Warszawskiej
Chromatorgrafia jonowymienna polega na wymianie zdolnych do wymiany jonów (dodatnich lub ujemnych) jonitu na inne jony o tym sammym łądunku zawartye w roztworze.
kationin - wymienia kationy (ma ujemne grupy funkcyjne by przyłączyć wymieniane cząstki) np. karboksymetoloceluloza
anionit np. dietyloaminoetyloceluloza
wiele analizowanych związków można rozdzielić na kolumnie jonowymiennej różnićae stezenie soli
Do rozdziału nie jenorodnych białek zasadowych stosuje się jonowymieniacz kationowy karboksymetylocelulozę z grupami kwasowymy
oczyszcza się nap białka histonowe
filtracja żelowa (chromatografia sita molekulrnego, sączenie molekularne)
Jony oraz substancje drobnoczastekczkowe yfundują łatwo w głądb ziaren żelu roztworu zalegający wewnerz żelu jest całkowicie dostępny dla tych substrancji
Większe czastki przepływają pierwsze.
Metoda nadaje się do odsalania białka.
Najogólniej sefadeks jest odpowiednio zmienionym dekstranem. Obróbka polega na wprowadzeniu mostków epichlorohydrynowych łączcych dwa sąsiednei ąłcuch dekstranu. Ilość takch porpzeczych mostków między łańcuchami dekstrnu wyznacza jednocześnei rozmiar oczek tak utworzonej sieci
Elektroforeza
SDS - PAGE
żele 5-15% do rozdziału białek globularnych między 10 kDa a 100 kDa. Żele 20-25% do zordziału peptydów.
Większe (masa cząsteczkowa) białko przyłącza więcej sds
bisakryloamid bywa dodawany
elektroforeza denaturująca - sds
relative mobility
(masa w skali logarytmicznej)
tu masę monomeru, na sefadeksie masę dimeru
chromatografia powinowactwa
Wykorzystuje poinowactwo białka do specyficznych grup chemicznych
Wykorzystuje np. konkanawalinę (lektyna) chętnie wiąże glukozę
połączenie kowalencyjne
Elucja interesujacego nas białka dużymi stężeniami rozpuszczalnej formy
Dawniej stosowano cyjanobromowana sefaroza
przeciwciała mocno wiążą - problem z wymyciem
wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa HPLC
Nośniki muszą być odporne na ściskanie w wysokim ciśnieniu do 5000 psi można stosować szybki przepłwy stosuje się do chromatografi jonowyienej w filtracji żelowej
chromatografia odzieływań hydrofobowych HIC
Białka adsorbują się na złożu dzięki występowaniu odziaływań dydrofobowych fragmetnów białak z silnie ydrofobowymi ligandami. przy steżeni soli bliskiej wysolieniu
Wymywająca fuborem o melajacym dradiencjie siły jonowej obiżając polarności
ogniskowanie izoelektrycznej
Technika wykorzystuej żóznice punktu izolektetycznego W tym pH ruchliwość elektroforetyczna jest rowna zero bo v=Ez/f gdzie
E - naęzenie pola elektrycznego
z wypadkowy ładunek czasteczki
f wspólczynk tacia
Gdy mieszanine baiłek podda isę elektroforezie w dradiencjie pH w żelu bez sds to kżde białeko będzi emigrowało do momentu osiągniecia pozcji w której pH żelu jest równe punktowi izoeketrcznemu baiłaka
Po ogniskowaniei elektroforeza SDS - eketroforeza dwukierunkowa (pi i masa)
Wirowanie w gradiencjei sacharozy
rotor do poziomego ukąłdu próbówki
oczyszanie craz lepsze:
homogenizacja
wysalanie
chromatografia jonowymiena
filtracja żelowa
chromatografia pofinowacctwa