Pałeczek Gram-ujemne niefermentujące glukozy.
Pałeczki niefermentujące glukozy są to pałeczki tlenowe, nie wytwarzające przetrwalników, które charakteryzuje brak zdolności fermentacji glukozy, tzn. rozkładania glukozy bez udziału tlenu.
Klasyfikacja pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących (wybrane rodzaje)
Rodzina: Pseudomonadaceae - pałeczki ruchome - rzęski biegunowe
Rodzaj: Pseudomonas Gatunek: P. aeruginosa
P. fluorescens
P. putida
P. stutzeri
P. mendocina
P. alcaligenes
Rodzaj: Burkholderia Gatunek: B. mallei
B. pseudomallei
B. cepacia
B. picketti
B. gladioli
Rodzaj: Comamonas Gatunek: C. acidovorans
C. terrigena
C. testosteroni
Rodzaj: Brevundimonas Gatunek: B. diminuta
B. vesicularis
Rodzaj: Stenotrophomonas Gatunek: S. maltophilia
Rodzaj: Sphingomonas Gatunek: S. paucimobilis
S. parapaucimobilis
S. yanoikuyae
S. adhesiva
S. capsulata
Rodzina: Methylococcaceae Rodzaj: Methylobacterium Rodzaj: Roseomonas
Rodzaj: Balneatrix
Rodzina: Alcaligenaceae - pałeczki ruchome - wkołorzese
Rodzaj: Alcaligenes Gatunek: A. faecalis
A. piechaudii
A. xylosoxidans spp. xylosoxidans
A. xylosoxidans spp. denitrificans
Rodzaj: Bordetella
Rodzina: Rhizobiaceae - pałeczki ruchome - wkołorzese
Rodzaj: Achromobacter Rodzaj: Agrobacterium Rodzaj: Ochrobactrum Rodzaj: Oligella
Rodzina: Cytophagaceae — pałeczki nieruchome — oksydazo-dodatnie
Rodzaj: Flavobacterium Gatunek: F. breve
F. gleum
F. indologenes
F. meningosepticum
F. odoratum
Rodzaj: Sphingobacterium
Rodzaj: Weeksella Gatunek: W. virosa
W. zoohelcum
Rodzaj: Moraxella Gatunek: M. lacunata
M. nonliąuefaciens M. osloensis M. phenylpryuvica M. atlantae
Pałeczki nieruchome — oksydazo-ujemne
Rodzaj: Acinetobactęr Gatunek: A. calcoaceticus
A. baumannii
A. haemolyticus
A. lwoffii
A. junii
A. johnsonii
Pałeczki te są obecnie częstą przyczyną zakażeń szpitalnych pacjentów z chorobami zagrażającymi życiu i z obniżoną odpornością organizmu. Wywołują one:
posocznice
zakażenia układu oddechowego
septyczne zapalenie stawów
zakażenia układu moczowego
pooperacyjne i pourazowe zakażenia ran
zapalenie spojówek i inne
Miejscem ich naturalnego występowania jest woda. gleba, ścieki i żywność. Mogą rozwijać się w ubogich w składniki odżywcze środowiskach. Stanowią również składnik mikroflory skóry (pachy, pachwiny, przestrzenie międzypalcowe) i są często przenoszone na rękach pacjentów i personelu szpitalnego (Acinetobactęr!).
Charakteryzują się wieloraką opornością na antybiotyki. Niektóre (np. Acir.etobacier) są oporne na wszystkie betalaktamy z grupy penicylin, inne (np. Stenotrophomonas maltophilia) na imipenem lub (Burkholderia cepacia) na gentamycynę.
Identyfikacja
Uwzględnia się takie cechy biochemiczne jak:
zdolność do fermentacji i oksydacji glukozy
zdolność do wzrostu na podłożu Mac Conkeya (nie rosną lub wzrost zahamowany: Fłavobacterium,Moraxella)
aktywność oksydazy cytochromowej (oksydazo-ujemne Acinetobactęr)
ruch (ruchu nie wykazują: Acinetobactęr, Flavobacterium, Moraxella)
wytwarzanie barwnika
hydroliza mocznika
redukcja azotanów
wytwarzanie indolu
dekarboksylacja aminokwasów
hydroliza eskuliny
W praktyce wykorzystuje się gotowe zestawy umożliwiające identyfikację do gatunku np. API 20NE, ID 32 GN w ramach systemu ATB Expression firmy bioMerieux.
1. Pseudomonas aeruginosa
Pałeczka ropy błękitnej, tlenowa, szeroko rozpowszechniona w przyrodzie (gleba, woda, ścieki, rośliny, owady, zwierzęta), chorobotwórcza dla roślin, owadów i zwierząt.
Zakażenia przez nią wywoływane najczęściej rozpoczynają się w miejscach wilgotnych np.
przy rurce tracheotomijnej
cewnikach
w miejscach oparzeń
uchu zewnętrznym („ucho pływaka")w ranach
zakażenia dróg moczowych
zakażenia dolnych dróg oddechowych
zapalenie rogówki, zakażenie wrzodu rogówki, zakażenie głębokie gałki ocznej
bakteriemie i posocznice
zapalenie wsierdzia
zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
ropnie mózgu
zakażenia kości i/lub stawów
endocarditis
Wytwarza barwniki fenazynowe, rozpuszczalne w wodzie i dyfimdujące do podłoża:
fluoresceina (piowerdyna) - barwnik fluoryzujący
piocyjanina (barwnik niebieski)
piorubryna (czerwony)
melanina (brązowy)
Szczepy szpitalne Pseudomonas aeruginosa mogą nie wytwarzać barwników!
Czynniki, które decydują o chorobotwórczości Pseudomonas aeruginosa:
egzotoksyna A
enterotoksyna (enteriłis, biegunka 5-dniowa w klimacie tropikalnym)
ciepłochwiejna fosfolipaza C (lecytynaza)
ciepłostały glikolipid wywołujący hemolizę krwinek w temp. 22-37°C
leukocydyna (uwalniana po lizie komórek - cytotoksyczne działanie na ludzkie leukocyty)
enzymy proteolityczne (elastaza, kolagenaza, żelatynaza, fibrynolizyna)
otoczka alginianowa, która jest zbudowana z polimeru kwasów marmurowego i glukuronowego. Szczepy wydzielające ten związek mają wygląd śluzowaty (połyskujący).
Rutynowa diagnostyka Pseudomonas aeruginosa
posiew materiału na:
• podłoże wybiórcze z cetrymidem (bromek cetylotrójmetyloamonowy 0.02% i kwas nalidyksowy 15 mg/l jako czynniki selektywne) np. Agar Pyocyanosel bioMerieux (może służyć do bezpośredniego posiewu kału, ropy lub moczu; zalecany do wykrywania P. aeruginosa w żywności i wodzie; używany zarówno w badaniach systematycznych w warunkach szpitalnych jak i w przemyśle - skażenie powierzchni, aparatury, przyrządów, środków antyseptycznych itd.) - obserwacja wytworzenia piocyjaniny i fluoresceiny (w świetle lampy UV) po inkubacji 24-48 godzinnej w temp. 35°C
• podłoże King B z nitrofurantoiną (zahamowanie rozwoju większości pałeczek Gram-ujemnych) - po 24 godzinnej inkubacji w temp. 35-37°C obserwacja w świetle lampy UV zielonej, niebieskiej lub zielono-żółtej fluorescencji. Pseudomonas aeruginosa wzrasta również na zwykłym podłożu agarowym i agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej, tworząc duże, szaro-brązowo-żółte kolonie (Morfologia kolonii: S-gładka, R-szorstka, M-śluzowa). Otoczenie kolonii zazwyczaj wybarwione jest na kolor żółtozielony lub zielononiebieski. Zapach: miodu lub jaśminu (trimetyloamina).
preparat barwiony metodą Grania - pałeczka Gram-ujemna wzrost w temp. 42°C w podłożu bulionowym
wykrywanie piocyjaniny w podłożu płynnym - warstwa chloroformu dodanego do 24h hodowli bulionowej zabarwia się na kolor zieloniebieski; na. powierzchni hodowli błonka
wykrywanie ruchu (urzęsienie biegunowe) w półpłynnym podłożu z dodatkiem TTC (chlorek trójfenylotetrazoliwy) - wzrost i zaczerwienienie w górnej części podłoża i wzdłuż linii wkłucia (parasol)
wykrywanie oksydazy cytochromowej - odczynnik tetrametylo-p-fenylodiamina reaguje z cytochromem c wytwarzając składnik koloru niebieskiego
metoda probówkowa: zawiesić badany szczep z 24h hodowli stałej w jałowe wodzie destylowanej a następnie dodać w/w odczynnik; w ciągu 30s do 2 min. szczep wytwarzający oksydazę powoduje powstanie intensywnego niebieskiego zabarwienia
metoda bibułowa: na krążek bibuły filtracyjnej umieszczonej w płytce Petriego nanieść 2-4 krople odczynnika a następnie za pomocą bagietki nanieść na bibułę z odczynnikiem badany szczep z 24h hodowli stałej; w ciągu 30s do 2 min. szczep wytwarzający oksydazę powoduje powstanie intensywnego niebieskiego zabarwienia
testy komercyjne:
Bactident Oxidase (Merck)
Oxidase test(bioMerieux)
Dry-slide oxidase (Difco)
rozkład glukozy (O/F) na podłożu Hugh-Leifsona zawierającym 1% glukozę oraz błękit
bromotymolowy jako wskaźnik barwny; badany szczep posiewa się do dwóch probówek
z podłożem Hugh-Leifsona, jedną z nich zalewa się jałową parafiną; inkubacja w temp.
35-37°C 24 godziny; zdolność do fermentacji glukozy (F) - zmiana zabarwienia do żółtego występuje w obu probówkach (z parafiną i bez parafiny);
zdolność do oksydacji glukozy (O) - zmiana zabarwienia do żółtego tylko w probówce
bez parafiny
Psedomonas aeruginosa powoduje oksydację glukozy, czyli nastąpi zmiana zabarwienia
tylko w probówce bez parafiny.
redukcja azotanów do azotynów - na podłożu o specjalnym składzie w obecności odczynników: a-naftolu w lodowatym kwasie octowym i kwasu sulfanilowego w lodowatym kwasie octowym;
zdolność redukcji azotanów do azotynów - powstanie czerwonego zabarwienia w ciągu
5 minut;
zdolność redukcji azotanów do wolnego azotu - brak czerwonego zabarwienia po
dodaniu sproszkowanego cynku, gdy nie wystąpiła w/w reakcja;
brak zdolności redukcji azotanów do azotynów - czerwone zabarwienie po dodaniu
sproszkowanego cynku
Pseudomonas aeruginosa redukuje azotany do wolnego azotu, ale niektóre szczepy mogą redukować azotany do azotynów.
wytwarzanie dihydrolazy argininy: enzym rozkłada argininę do omityny, amoniaku i CO2, co powoduje wzrost pH (zmiana zabarwienia wskaźnika-czerwieni fenolowej z żółtej na czerwoną)
redukcja TTC: powstaje czerwony strat (formazon) w hodowli płynnej lub czerwono zabarwione kolonie na podłożu agarowym
identyfikacja do gatunku za pomocą biochemicznych mikrotestów komercyjnych: API 20 NE i ID 32 GN w ramach systemu ATB Expression (bioMerieux)
typowanie pałeczek P. aeruginosa dla celów epidemiologicznych (identyfikacja wewnątragatunkowa): serologiczne, bakteriofagowe, bakteriocynowe (piocynowe), biochemiczne, enzymatyczne, genetyczne.
Pałeczki P. aeruginosa charakteryzuje naturalna oporność na liczne leki (penicylina G, ampicylina, cefalosporyny I—II generacji, tetracykliny, linkozamidy, stare chinolbny). Aktywne mogą być: karbenicylina, tikarcylina, ureidopenicyliny (piperacylina), aztreonam (monobaktamy), ceftazydym i cefoperazon (cefalosporyny III generacji), cefpirom (IV generacja cefalosporyn), imipenem i meropenem (karbapenemy),
Timentin i Tazocin (preparaty skojarzone), aminoglikozydy i fluorochinolony (wysokie odsetki szczepów opornych).
2. Acinetobacter sp.
Gram-ujemna ziarniako-podobna-pałeczka, tlenowa, szeroko rozpowszechniona w przyrodzie (środowisko wodne, gleba, żywność, u ludzi i zwierząt). U człowieka bytuje na skórze (pachy, pachwiny, przestrzenie między palcami nóg), rzadziej kolonizuje przewód pokarmowy, jamę nosowo-gardłową i pochwę.
Wywołuje zakażenia u chorych o zmniejszonej odporności, po zabiegach inwazyjnych, ciężkich i
Długotrwałych zabiegach chirurgicznych. Jest to drobnoustrój powodujący typowe zakażenia szpitalne. Może wywoływać:
zakażenia dolnych dróg oddechowych (chorzy intubowani)
bakteriemie i posocznice
zapalenie otrzewnej (u chorych dializowanych)
zakażenia układu moczowego (chorzy z cewnikami założonymi na stałe)
zapalenie opon mózgowych (po zabiegach neurochirurgicznych)
zapalenie spojówek i/lub gałki ocznej
zapalenie wsierdzia
zapalenie stawów, kości i szpiku
zakażenia skóry i ran
Nie wytwarza barwników (obserwowano powstawanie brązowego barwnika przechodzącego do podłoża wyłącznie na agarze z wyciągiem z serca wołowego).
Diagnostyka:
preparat barwiony metodą Grama - Gram-ujemna ziamiako-podobna-paleczka
dobrze rośnie na podłożu Mac Conkeya (z wyjątkiem nielicznych szczepów A. lwoffii), na zwykłym podłożu agarowym i na podłożu agarowym z krwią
nie wykazuje ruchu (brak urzęsienia)
oksydazo-ujemna
rozkład tlenowy glukozy na podłóżu:. Hugh-Leifsona
brak zdolności redukcji azotanów do azotynów
nie wytwarza dihydrolazy argininy
W identyfikacji do gatunku wykorzystuje się testy fenotypowe, np. API 20 NE lub ID 32 GN bioMerieux. Obecnie wyróżnia się 12 gatunków genetycznych wyodrębnionych dzięki technice hybrydyzacji DNA-DŃA. Z materiałów klinicznych najczęściej izoluje się gatunek A. baumannii, natomiast rzadziej inne gatunki: A. lwoffii, A. johnsonii, A. junii, A. haemolyticus.
Acinetobacter baumannii charakteryzuje wieloraka oporność na antybiotyki. Aktywne mogą być nieliczne leki, m.in. ceftazydym, imipenem i meropenem, fluorochinolony oraz skojarzenia ceftazydymu i cefotaksymu z aminoglikozydami lub fluorochinolonami.