CCF20121201012

z

Ślepa próba odczynnikowa:_ .

Do probówki odmierzyć SOOpl H₂0 , a następnie 4 ml p-glicerofosforanu i 500 pl 60% CCI3COOH. Po dokładnym wymieszaniu odpipetować Iml mieszaniny do probówki nr 5 a następnie dodać 2 ml H₂0.________

Ślepa próba surowicy:

Służy do oznaczenia ilości fosforu występującego w stanie wolnyyw surowicy._.

Do probówki dajemy SOOpl surowicy i 4 ml P-glicerofosforanu i natychmiast!!!! 500pl CCI3COOH (w celu przerwania reakcji enzymatycznej). Próbkę przesączamy do kolejnej probówki a następnie odpipetowujemy lml przesączu do probówki nr 6 i dodajemy 2ml H₂0

Właściwe oznaczenie fosfatazy zasadowej w surowicy____________

Do probówki odmierzyć 500 pl surowicy i 4 ml p-glicerofosforanu , a następnie umieścić probówkę w łaźni wodnej (37°C) na okres 30 minut. Po upływie tego czasu reakcję przerywamy dodając 5OOMŁCCI3COOH. Następnie próbkę przesączamy, lml przesączu odpipetowujemy do probówki nr 7 i dodajemy 2 ml H₂Q________

Ustawiamy probówki od 1-7 w statywie i w celu wywołania reakcji barwnej dodajemy do wszystkich probówek 800 pl roztworu molibdenianu amonu i 200 pl eikonogenu. Bardzo dokładnie próbki mieszamy i pozostawiamy na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po tym okresie mierzymy absorbancję próbek przy fali o długości X = 660nm wobec próby ślepej odczynnikowej

Na podstawie odczytanych wartości absorbancji wykreślić na papierze milimetrowym krzywą standardową i odczytać ilość pg. P znajdującego się w. ślepej próbie surowicy i próbie właściwej. Od ilości fosforu w badanej próbce odjąć Wartość uzyskaną dla ślepej próby surowicy (ilość fosforu występująca w stanie wolnym w surowicy). Różnica odpowiada ilości pg fosforu odszczepionego w czasie inkubacji przez enzymatyczną hydrolizę p-glicerofosfaranu pod wpływem alkalicznej fosfatazy zawartej w lOOpl surowicy

Stwierdzona ilość pg P/ 100 pl surowicy    ilość mg P/ lOOml surowicy = ilość

jednostek Bodeńskiego

Jednostka Bodeńskiego - jest to ilość fosfatazy zasadowej,która powoduje odszczepienie 1 mg fosforu z P-glicerofosforanu W środowisku o pH 8,6 w ciągu godziny w temp. 37°C.