Skan
3 bmp

ćwiczenie 6.24. Oznaczanie białka metodą Bradforda (M.M. Bradford 1976, Anal. Blochem., 72:248-254)

Zasada: W metodzie tej wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem głównie reagują reszty Arg; w minimalnym stopniu reszty His, Lys, Tyr, Trp i Phe. Błękit brylantowy Coomassie G-250 w środowisku kwasowym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum pochłaniania z 465 na 595 nm. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze.

Zaletami tej metody są: prostota wykonania, duża szybkość i czułość. Oznaczenia można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, Mg^z+, związków tiolowych, sacharozy, glicerolu.

Wadą metody, podobnie jak i techniki Lowry’ego i wsp. (patrz ćw. 6.22) są różnice w wiązaniu barwnika przez różne białka. Ponadto detergenty, takie jak SDS. Triton X-100, dają w połączeniu z barwnikiem dodatkowy interferujący kolor, co przeszkadza w uzyskaniu wiarygodnych wyników. Interferencję wywołaną przez niewielką ilość detergentu można wyeliminować wykorzystując odpowiednią próbę kontrolną.

Materiał: Surowica krwi.

Odczynniki:

1)    Roztwór macierzysty barwnika: 0,05% Coomassie Brilliant Blue G-250 - 23.8% etanol - 42,5% kwas ortofosforowy(V). 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpuścić w 50 ml 56% etanolu, dodać 100 ml 85% kwasu o-fosforowego{V) i uzupełnić H₂0 do 200 ml. Roztwór macierzysty przechowywać w ciemnej butelce; w temp. 4°C jest trwaty.

2)    Roztwór roboczy barwnika: I objętość roztworu macierzystego rozcieńczyć 4 objętościami H,0. Trwałość roztworu przechowywanego w ciemnej butelce w lodówce wynosi 2 tygodnie. Przed użyciem należy go przesączyć.

3)    Roztwór wzorcowy BSA o stężeniu 0,5 mg/ml.

4)    0,9% roztwór NaCl.

Wykonanie: Z roztworu wzorcowego albuminy sporządzić szereg rozcieńczeń o stężeniach: 50, 100, 200, 300 i 400 pg białka w 1 ml 0,9% NaCl. Do 50 pi roztworów białka (50-400 pg/ml) łub surowicy krwi (uprzednio rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl 50 i 100 razy) dodać 2,5 ml roztworu barwnika, a następnie po 5 min, lecz przed upływem 60 min, dokonać pomiaru absorbancji (względem próby kontrolnej) przy X = 595 nm w kuwetach szklanych lub polistyrenowych. Z krzywej wzorcowej obliczyć zawartość białka w badanej próbce surowicy krwi.

Uwagi: 1) Zaleca się użyć Serva Blue G, który ma większą zawartość barwnika niż Coomassie Blue G i daje mniejsze różnice w barwie zależnie od - rodzaju białka. 2) Do pomiaru najlepiej użyć kuwet polistyrenowych, ponieważ barwnik ma tendencję przylegania do ścian kuwety. Kuwety można płukać między oznaczeniami metanolem. Myje się je zanurzając na kilka godzin w 0,1 M roztworze HC1.