wymagania# bmp

240 METODY OPARTE NA WIDMACH MOLEKULARNYCH

w kasetę obróbki danych Data Handling 1, gdzie pochodna jest obliczana przy użyciu 9 punktów. Savitsky i Golay [3.30, 3.31] wprowadzili aproksymacyjny sposób obliczania pochodnych. Fragment krzywej (pewna liczba punktów doświadczalnych, np. pierwsze 9) jest opisywany odpowiednim wielomianem (wyznaczonym metodą najmniejszych kwadratów). Wielomian jest różniczkowany i obliczana jest wartość pochodnej dla środkowego punktu z wybranego przedziału. Następnie od wybranego przedziału punktów odrzuca się pierwszy punkt, dodaje kolejny i całą procedurę obliczania powtarza się aż do uzyskania całego widma. Kształt widma pochodnej zależy od rzędu pochodnej, liczby punktów, stopnia wielomianu, odległości międzypunktowej oraz tzw. gładzenia widma, czyli takiej obróbki matematycznej widma, w wyniku której otrzymuje się widmo lub pochodną o regularniejszym przebiegu. Optymalizację parametrów różniczkowania numerycznego można przeprowadzić stosując spektrofotometry umożliwiające zapis rejestrowanych widm w pamięci komputera, a następnie stosowanie do obliczenia pochodnej odpowiedniego programu komputerowego.

Widmo pierwszej pochodnej może być otrzymywane za pomocą spektrofotometru dwufalowego, który rejestruje nie absorbancję, lecz różnicę absorbancji dla założonej różnicy długości fal dwóch strumieni świetlnych.

Spektrofotometria pochodna odpowiedniego rzędu umożliwia [3.32]:

' —jednoczesne oznaczanie kilku składników w mieszaninie,

—    oznaczanie składników śladowych bez wydzielania i oddzielania ich od matrycy,

—    w wielu przypadkach wzrost selektywności i czułości w porównaniu ze spektrofotometrią klasyczną,

—    eliminację tła i zmętnienie próbki oraz widm substancji przeszkadzających o małej złożoności przebiegu (szerokie, płaskie pasma),

—    wyznaczenie dokładnych wartości X_max a także punktów przegięcia,

—    wykorzystanie nawet bardzo słabych pasm, które na krzywej absorpcji powodują przegięcia lub zmiany kąta jego nachylenia,

—    identyfikację związków organicznych na podstawie pochodnej odpowiedniego rzędu.

Wadą spektrometrii pochodnej jest znaczna wrażliwość na zmiany parametrów aparaturowych analizy. Popełnienie błędu w rejestracji widma zerowego rzędu jest przyczyną niepowtarzalności metody. Nieznaczne różnice w ustawieniu długości fali w spektrometrach mają istotny wpływ na wynik, szczególnie przy technice „zero-crossing”. Metoda wymaga stosowania odpowiednich metod matematycznych.

3.2.7. Wykonanie oznaczenia spektrofotometrycznego

Wybór długości fali i stężeń roztworów wzorcowych '

W spektrofotometrii ilościowej przed przystąpieniem do pomiarów należy zastanowić się nad:

—    wyborem analitycznej długości fali (przy której będą wykonane pomiary),

—    doborem odpowiednich stężeń substancji oznaczanej,

—metodą pomiaru.

Analityczną długość fali X wybiera się na podstawie krzywej absorpcji (rys. 3.43).

Pomiary wykonane przy X_max odznaczają się największą dokładnością i czułością. Z rysunku 3.43 wynika, że zmiana stężenia w przedziale pi — P2 o Ap powoduje zmianę absorbancji o AA. Przy X_max wartość AA jest znacznie większa niż przy X_m;„. Chociaż praktyczny błąd pomiaru ab-

Rysunek 3.43. Porównanie dokładności pomiaru absorbancji roztworu dla różnych długości fali: a) krzywe absorpcji, b) zależność absorbancji od stężenia przy X_max i ^min