FARMAKOPEA POLSKA WYD. VII TOM I
2.6.14. ENDOTOKSYNY BAKTERYJNE
Przed użyciem, ogrzewać podłoże 5 min w łaźni wodnej i ochłodzić. Do każdej probówki dodać 0,5 ml roztworu pi-rosiarczynu sodu OD (12 g/1) i 0,5 ml roztworu cytrynianu żelaza(III)-amonowego (10 g/1). Oba roztwory powinny być przygotowane bezpośrednio przed użyciem i przesączone przez sączek membranowy (wielkość porów: 0,45 pm).
Agarowe podłoże S (R2A)
Magnezu siarczan bezwodny 0,024 g
Woda oczyszczona 1000 ml
Doprowadzić pH, aby po sterylizacji wynosiło 7,2 ± 0,2. Wyjaławiać 15 min w sterylizatorze parowym w temp. 121°C.
CZYNNIKI NEUTRALIZUJĄCE
Czynniki neutralizujące mogą być stosowane do neutralizacji aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Neutralizatory mogą być dodawane, najlepiej przed sterylizacją do zbuforowanego roztworu chlorku sodu z peptonem o pH 7,0. Jeżeli są stosowane, należy wykazać ich skuteczność neutralizacji oraz brak działania toksycznego w stosunku do drobnoustrojów.
Typowy roztwór neutralizujący ma następujący skład:
Pepton (mięsny lub kazeinowy) ’ lg
Disodu wodorofosforan dwuwodny 7,2 g
Woda oczyszczona 1000 ml
■Wyjaławiać 15 min w sterylizatorze parowym w temp. 121°C.
Jeżeli roztwór wykazuje niedostateczne właściwości neutralizujące, można zwiększyć stężenie polisorbatu 80 lub lecytyny.
Zamiennie, można stosować neutralizatory zamieszczone w tabeli 2.6.13.-3.
01/2005:20614
Badanie obecności endotoksyn bakteryjnych (test LAL) jest wykonywane w celu wykrycia lub oznaczenia zawartości endotoksyn bakterii Gram-ujemnych, z zastosowaniem lizatu amebocytów skrzypłocza (Limulus polyphemus lub Tachypleus tridentatus). Wyróżnia się trzy techniki badania: żelową polegającą na utworzeniu żelu; zmętnieniową (turbidymetryczną), polegającą na wywołaniu zmętnienia w wyniku rozszczepienia endogennego substratu oraz chromogenną polegającą na powstaniu zabarwienia w wyniku enzymatycznego rozszczepienia syntetycznego kompleksu peptyd-chromogen.
W rozdziale opisano 6 następujących metod:
Metoda A. Metoda żelowa: badanie graniczne
Metoda B. Metoda żelowa: badanie półilościowe
Metoda C. Zmętnieniową (turbidymetryczną) metoda kinetyczna
Metoda D. Chromogenną metoda kinetyczna
Metoda E. Chromogenną metoda pomiaru punktu końcowego
Metoda F. Zmętnieniową metoda pomiaru punktu końcowego
Oznaczenia można przeprowadzać każdą z wyżej wymienionych 6 metod. Jeżeli wyniki otrzymane po wykonaniu badań jedną z tych metod są wątpliwe lub sporne, to znaczenie rozstrzygające mają wyniki uzyskane metodą A, jeżeli nie podano inaczej w monografii.
Badania wykonywać w warunkach zabezpieczających próbki i sprzęt przed zanieczyszczeniem endotoksynami.
Aparatura
Pozbawić endotoksyn szkło i inny sprzęt odporny na ogrzewanie przez umieszczenie w suszarce używając zwalidowa-nego procesu. Powszechnie stosowany jest czas co najmniej 30 min i temp. 250°C. Jeżeli używana jest aparatura z tworzywa sztucznego, np. płytki mikrotitracyjne czy końcówki do pipet automatycznych, to musi ona być sprawdzona na nieobecność endotoksyn i czynników zakłócających test, tzw. czynników interferujących.
UWAGA: W monografii termin „probówki" odnosi się do wszystkich naczyń używanych w badaniu, np. dołków płytek mikrotitracyjnych.
Przygotowanie roztworu podstawowego endotoksyny wzorcowej
Roztwór podstawowy endotoksyny wzorcowej jest sporządzany z porównawczej endotoksyny wzorcowej mianowanej wobec Międzynarodowego Wzorca, np. endotoksyny wzorcowej BPP.
Tabela 2.6.13.-3. Substancje neutralizujące czynniki przeciwdrobnoustrojowe dodawane do zbuforowanego roztworu
chlorku sodu z peptonem o pH 7,0
Rodzaj czynnika przeciwdrobnoustrojowego |
Substancja neutralizująca |
Stężenie |
Uwagi |
Związki fenolowe |
Sodu laurylosiarczan Polisorbat 80 i lecytyna Żółtko jaja |
4 g/1 30 g/1 i 3 g/1 5 ml/1 - 50 ml/1 |
Dodać do jałowego zbuforowanego roztworu chlorku sodu z peptonem o pH 7,0 |
Organiczne związki rtęci |
Sodu tioglikolan |
0,5 g/1 - 5 g/1 | |
Związki halogenowe |
Sodu tiosiarczan |
5 g/1 | |
Czwartorzędowe związki amoniowe |
Żółtko jaja |
5 ml/1 - 50 ml/1 |
Dodać do jałowego zbuforowanego roztworu chlorku sodu z peptonem o pH 7,0 |
Wskazówki ogólne” (1) odnoszą się do wszystkich monografii i innych tekstów
261