9

2.6.14. ENDOTOKSYNY BAKTERYJNE

FARMAKOPEA POLSKA WYD. VII TOM I

Moc endotoksyny jest wyrażana w Jednostkach Międzynarodowych (IU). Moc Międzynarodowego Wzorca została określona w IU przez Światową Organizację Zdrowia.

UWAGA: Jedna Jednostka Międzynarodowa (IU) endotok-syny jest równoważna jednej Jednostce Endotoksyny (E. U.).

Sporządzając i przechowując roztwór podstawowy endotoksyny wzorcowej postępować zgodnie ze specyfikacją zamieszczoną w ulotce dołączonej do opakowania oraz na etykiecie opakowania bezpośredniego.

Przygotowanie roztworów endotoksyny wzorcowej

Roztwór podstawowy endotoksyny wzorcowej energicznie wymieszać i sporządzić odpowiednie seryjne rozcieńczenia tego roztworu używając wody do badania endotoksyn bakteryjnych (woda LAL).

Roztwory zużyć jak najszybciej, aby zapobiec utracie aktywności na skutek adsorpcji.

Przygotowanie roztworów badanych

Roztwory badane przygotować przez rozpuszczenie lub rozcieńczenie substancji czynnych lub produktów leczniczych wodą LAL. Niektóre substancje lub produkty mogą wymagać rozpuszczenia lub rozcieńczenia w innych roztworach wodnych. Jeżeli konieczne, doprowadzić pH roztworu badanego (lub jego rozcieńczenia) do takiej wartości, aby po zmieszaniu z lizatem, pH mieszaniny odpowiadało zakresowi określonemu przez producenta lizatu. Zwykle wystarcza, aby wartość pH produktu znajdowała się w zakresie od 6,0 do 8,0. Odczyn produktu można doprowadzić do wymaganej wartości pH za pomocą kwasu, zasady lub odpowiedniego buforu zgodnie z zaleceniami producenta lizatu. Roztwory kwasów i zasad mogą być przygotowane w tym celu z roztworów stężonych lub stałych postaci tych związków z użyciem wody LAL i naczyń wolnych od wykrywalnych endotoksyn. Należy sprawdzić, czy roztwory buforowe są wolne od endotoksyn i czynników interferujących.

Określanie Największego Dopuszczalnego Rozcieńczenia

Największe Dopuszczalne Rozcieńczenie (NDR) jest to maksymalne rozcieńczenie próbki, w którym możliwe jest oznaczenie granicznej zawartości endotoksyn. NDR oblicza się wg następującego wzoru:

_ Sranie™² zawartość endotoksyn x stężenie roztworu badanego

Graniczna zawartość endotoksyn: graniczna zawartość endotoksyn w substancji czynnej stosowanej pozajelitowo zależy od jej dawkowania i jest wyrażona wzorem:

K

~M

K = progowa dawka gorączkotwórcza endotoksyny w przeliczeniu na kilogram masy ciała zastosowana w czasie do jednej godziny,

M- najwyższa zalecana dawka lecznicza produktu w przeliczeniu na kilogram masy ciała zastosowana w czasie do jednej godziny.

W monografiach graniczna zawartość endotoksyn w substancji czynnej stosowanej pozajelitowo jest wyrażana w jednostkach takich jak IU/ml, IU/mg, IU/jednostkę aktywności biologicznej itp.

Stężenie roztworu badanego:

-    w mg/ml, jeżeli graniczną zawartość endotoksyn określono w przeliczeniu na jednostkę masy (IU/mg),

-    w jednostkach/ml, jeżeli graniczną zawartość endotoksyn określono w przeliczeniu na jednostkę aktywności biologicznej (IU/jednostkę),

-    w ml/ml, jeżeli graniczną zawartość endotoksyn określono w przeliczeniu na jednostkę objętości (IU/ml).

X = deklarowana czułość lizatu w technice żelowej (IU/ml) lub najniższy punkt krzywej wzorcowej w technikach turbidy-metrycznej lub chromogennej.

TECHNIKA ŻELOWA (METODY A i B)

Technika żelowa umożliwia wykrycie lub oznaczenie zawartości endotoksyn i polega na krzepnięciu lizatu w obecności endotoksyn. Stężenie endotoksyn konieczne do skrzepnięcia lizatu w standardowych warunkach reakcji określa deklarowaną czułość lizatu. Dla zapewnienia precyzji i wiarygodności badania wykonać oznaczenia potwierdzające deklarowaną czułość lizatu i przeprowadzić test na obecność czynników interferujących jak opisano w części    Badania wstępne".

1. BADANIA WSTĘPNE

(i) Potwierdzenie deklarowanej czułości lizatu

Deklarowaną czułość roztworu lizatu X wyrażoną w IU/ml potwierdzić w czterech powtórzeniach przed zastosowaniem lizatu do oznaczeń. Potwierdzenie czułości lizatu wykonuje się dla każdej nowej serii lizatu lub w przypadku wprowadzenia jakiejkolwiek zmiany w warunkach oznaczeń, która mogłaby wpłynąć na wynik badania.

Sporządzić roztwory wzorcowe w co najmniej 4 stężeniach odpowiadających 2X, \ X, 0,5 A. i 0,25 X, rozcieńczając wodą LAL roztwór podstawowy endotoksyny wzorcowej.

Zmieszać w każdej probówce równe objętości (najczęściej po 0,1 ml) roztworu lizatu z każdym z roztworów wzorcowych. W przypadku stosowania liofilizowanego lizatu w jednorazowych fiolkach lub ampułkach, roztwory endotoksyny dodawać bezpośrednio do fiolek lub ampułek. Mieszaninę reakcyjną inkubować z zachowaniem stałego czasu w warunkach zgodnych z zaleceniami producenta lizatu (zwykle w temp. 37 ± 1°C przez 60 ± 2 min), chroniąc od wstrząsów. Sprawdzić spoistość żelu. Jeżeli użyto probówek, wyjmować je po kolei z inkubatora i łagodnym ruchem odwracać o ok. 180°. Za wynik dodatni uznaje się powstanie spoistego żelu, przylegającego do dna probówki po jej odwróceniu. Wynik testu jest ujemny, jeżeli żel taki nie powstał.

Badanie nie jest wiarygodne, jeżeli w roztworach o najniższym stężeniu endotoksyny wzorcowej wynik nie jest ujemny we wszystkich czterech powtórzeniach.

Ostatni dodatni wynik w serii malejących stężeń endotoksyny jest określany jako punkt końcowy. Obliczyć średnią wartość logarytmów stężeń w punktach końcowych, a następnie jej antylogarytm wg wzoru:

Średnia geometryczna stężeń w punkcie końcowym =

= suma logarytmów stężeń w punkcie końcowym w zastosowanych seriach rozcieńczeń,

/    = liczba powtórzeń.

262

Patrz trzecia strona okładki: część informacyjna dotycząca monografii ogólnych