Diagnostyka mikrobiologiczna podstawą antybiotykoterapii

Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej we Wrocławiu

Ogolny schemat badania mikrobiologicznego

Badanie laboratoryjne próbki

Doradztwo przed i badaniem

Interpretacja wyniku badania

Badanie mikrobiologiczne

Decyzja o doborze próbki Pobranie materiału

i Wypełnienie skierowania

i Przechowywanie i transport próbki

i Wykonanie badania

■ Izolacja drobnoustroju

■ Identyfikacja drobnoustroju

■ Antybiogram

■ Oznaczenie mechanizmu oporności

■ Interpretacja wyniku

i Konsultacja dotycząca antybiotykoterapii

WSPOLPRACA

i Lekarz

- określenie kierunku badania

- prawidłowe pobieranie i przesłanie próbki diagnostycznej

i Mikrobioloa

- prawidłowe wykonanie badania i Lekarz + mikrobioloa

- interpretacja wyniku, podjęcie decyzji o właściwej terapii

ZA DUZO OBRAZKOW IMG_4345

Warunki jakie powinien spełniać wyiik

badania mikrobiologicznego ?

i Wynik reprezentatywny i Wynik wiarygodny i Wynik porównywalny i Wynik przydatny i Wynik we właściwym czasie i Wynik za właściwą cenę

METODY KLASYCZNE

i Hodowla • izolacja drobnoustroju i Identyfikacja zarazka i Oznaczenie wrażliwości

SZYBKIE METODY

i Preparat

i Wykrywanie antygenu

a/metody serologiczne • aglutynacja lateksowa 1 I - immunofluorescencja

b/fluorocytometria

c/ wykrywanie enzymów, fragmentów ściany kom. - chromatografia gazowo- cieczowa

• ogniskowanie izoelektryczne d/ wykrywanie kw. nukleinowych - metody hybrydyzacji, sondy

• metody amplifikacji: PCR, LCR

MLST, RT-PCR. QC-PCR, NASBA, nested-PCR

random-PCR. mulllply-PCRV

Antybiotykoterapia zakażeń

bakteryjnych

Racjonalna antybiotykoterapia to:

i Uzyskanie dobrego efektu leczniczego

i Zminimalizowanie selekcji szczepów opornych

- Lecznictwo otwarte S. pneumoniae oporny na penicyliny

- Lecznictwo szpitalne MRSA, MRCNS, VRE, VISA, VRSA, pałeczki Gram (-) ESBL, MBL, Amp C

Antybiogram podstawowy

DOBOR ABTYBIOTYKOW

-rodzaj wyhodowanego patogenu

-rozpoznanie kliniczne - miejsce infekcji

- wiek pacjenta

Metody oznaczania wrażliwości

METODY JAKOSCIOWE

*dyfuzyjne

*polautomatyczne stezenia graniczne

*automatyczne

METODY ILOSCIOWE- wyznaczanie MIC

*seryjne rozciencznia

*E-testy

METODY PRZEGLADOWE

* oznaczania wrażliwości na glikopeptydy szczepów Enterococcus VA-I (wanko 6 ug) / Staph, aureus (wanko 4ug)

"Oznaczanie wrażliwości szczepów Staph, aureus na oksacylinę OX-I (oxa 6 ug)

METODY GENETYCZNE

oznaczanie metodą PCR genów mecA, erm, vanA

Wykrywanie mechanizmów oporności

OKRESLANIE FENOTYPU

* BETA- laktamazy chromosomalne (test cefinazowy)

* metycylinooporność (oxacylina 1 fig)

* oporność typu HLAR (120 fig-Ge, 300 fig-Sr)

* ESBL - B laktamazy szerokosubstratowe

* MLS_B - oporność dysocjacyjna

IBL - p laktamazy indukcyjne MLB - metalo BETA laktamazy

OKRESLANIE GENOTYPU

metody genetyczne - sondy

metody molekularne - homologia białek

Alert patogeny

Drobnoustrój	Fenotyp oporności
i p-hemolizujące paciorkowce	erytromycyna lub/i penicylina lub/i glikopeptydy
i Strptococcus pneumoniae	penicylina lub/i erytromycyna lub/i glikopeptydy
i Enterococcus spp.	Glikopeptydy lub/i wysokie stężenia genta/strepto lub/i wytwarzanie p-laktamazy (oporność na penicylinę w tym mech.)
i Staphylococcus aureus	MRSA lub/i Wankomycyna lub/i teikoplanina
i SCN	Wankomycyna, teikoplanina

Alert patogeny

Drobnoustrój Neisseria meningitidis	Fenotyp oporności penicylina
i Haemophilus influenzae	ciprofloksacyna lub/i nowa gen. fluorochinolonów, cefalosporyny III gen., szczepy BLNAR
i Enterobacteriaceae. i inne pał	ciprofloksacyna lub/i nowe fluorochinolony lub/i gentamycyna i inne aminoglikozydy karbapenemy i ESBL
i Acinetobacter	karbapenemy lub/i genta lub/i inne aminoglikozydy, MBL
i Pseudomonas aeruginosa p-laktamazy Gram(-) pałeczek I p -laktamazy gatunkowo specyficzne • enzymy "stare" ewolucyjnie kodowane chromosomalnie, charakterystyczne dla danego gatunku bakterii, produkowane zazwyczaj na dość niskim pozornie, waskosubstratowe i wtórne p-laktamazy- pochodzące od specyficznych gatunkowo chromosomalnych enzymów, które rozprzestrzeniły się dzięki przeniesieniu na plazmid | « ESBL (ang. extended spectrum b-lactamases) - blaktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym, kodowane plazmidowo, powstałe na skutek pojedynczych mutacji z wtórnych b-laktamaz. I i IBL (ang. inducible p -lactamases) - p -laktamazy indukcyjne, kodowane chromosomalnie lub plazmidowo p-laktamazy derepresorowane- enzymy powstałe na skutek pojedynczej mutacji, która powoduje stałą ekspresje genu chromosomalnego ampC na bardzo wysokim poziomie niezależnie od obecności induktora (antybiotyku) Enzymy ESBL i Mają zdolność do hydrolizy wielu antbiotyków I p-laktamowych: 'penicylin *cefalosporyn I, II, lllg. z wyjątkiem cefamycyn *monobaktamów i Nie hydrolizują karbapenemów i Są częściowo wrażliwe na Inhibitory p-laktamaz (kw. klawulanowy, sulbactam, tazobactam) i Najczęściej Rodziny TEM, SHV, CTX-M fj-laktamazy typu AmpC ł Enzymy powstałe na skutek spontanicznej mutacji, która powoduje całkowite odblokowanie ekspresji gatunkowo specyficznej, indukcyjnej, chromosomalnej b-laktamazy. ł Odblokowanie (derepresja) genu ampC powoduje wytwarzanie enzymu na niezwykle wysokim poziomie, niezależnym już od obecności induktora w środowisku, jednocześnie zwiększając zakres hydrolizowanych substratów (antybiotyków). ♦ Odblokowane AmpC b-laktamazy hydrolizują: wszystkie penicyliny, cefalosporyny (tak cefamycyny), monobaktamy i penicyliny z inhibitorami b-laktamaz Nie rozkładają KARBAPENEMOW ♦ Produkowane są najczęściej przez szczepy Enterobacter, Citrobacter, Serratia i Morganella. Metody stosowane do oznaczania ESBL METODY DYFUZYJNE - test dwóch krążków (DDST) - czułość zwiększa dodanie krążków z aztreonamem i cefpodoksymem - metoda E-testów (cefotaksym, ceftazydym + te antybiotyki z inhibitorami) - metoda przeglądowa (tylko dla E.coli i Klebsiella) METODY ROZCIENCZENIOWE test ATB BLSE - metoda półautomatyczna test VITEK GNS-NT - metoda automatyczna METODY GENETYCZNE - ogniskowanie izoelektryczne - oznaczanie metodą PCR genów bla ■ sekwencjonowanie genów OBRAZEK IMG_4378 OBRAZEK IMG_4381 OBRAZEK IMG_4382	ceftazydym lub/i inne cef. IV gen. i/lub tazobactam lub/i genta lub inne aminog.. karbapenemy, MBL i ESBL

OBRAZEK IMG_4383

OBRAZEK IMG_4384

i Oporność enterokoków

i Naturalnie oporne na: cefalosporyny, linkozamidy, niskie stężenia aminoglikozydów, polimyksyny, kotrimoksazol (£ faecium na karbapenemy)

i Oporność na penicyliny (produkcja p laktamaz, zmiany białek PBP)

i Oporność na wysokie stężenia aminoglikozydów -szczepy HLAR

i Oporność enterokoków na glikopeptydy - VRE

* Van A - oporność wysokiego stopnia na wankomycynę i teikoplaninę ^:

* Van B - oporne na wankomycynę, wrażliwe na teikoplaninę

* Va C - konstytutywna oporność na niskie stężenia

wankomycyny przy zachowanej wrażliwości na teikoplaninę u £ galinarum,E. casseliflavus

* Van D - konstytutywna oporność na vankomycyne i niskie stężenia teikoplaniny u E.taecium

i - oporność (średni poziom) na wankomvcvne u E.faecalis

Mechanizmy oporności na glikopeptydy

Oporność na glikopeptydy (VRE) jest związana z uzyskaniem przez szczep genu van A, który koduje syntezę nowego białka.Bia ko to hamuje łączenie VA z jej miejscem docelowego działania (końcowy odcinek pentapeptydu będącego prekursorem syntezy 1 peptydoglikanu) tj. D-alanylo-D-alaniną przez zmianę na D-a la-D-mleczan (pierwsze szczepy. 1986 r., lata 1989 - 2000 wzrost z 0,3% do 25,2%)

i W szczepach VRSA (2002 r.) nastąpiło przeniesienia genu vanA od Enterococcus faecium (miejsce j docelowe zmienione jest na D-alanylo-D-serynę)

■ Szczepy VISA (1996 r.) o zmniejszonej wrażliwości na wankomycynę mają inny mechanizm oporności. Jest to nadprodukcja prekursorów peptydoglikanu a tym samym utrudniony dostęp Białko to hamuje łączenie VA z jej miejscem docelowego działania

MECHANIZMY OPORNOŚCI BAKTERYJNEJ NA

MAKROLIDY

MLSb- oporność konstytutywna lub Indukowana tzw. oporność „dysocjacyjna" u paciorkowców i gronkowcow.

fen typ oporności Jest wynikiem ekspresji genów erm • enzym powoduje metylacię rybosomalnego RNA (50s), a zatem osłabienie lub całkowity zanik powinowactwa tych antybiotyków do zmienionego rybosomu. Małe stężenia erytromycyny indukują oporność na wszystkie makrolidy, linkosamidy I streptograminy B

MSb- mechanizm wypompowywania makrolidów i streptogramin B z komórki typu efflux

Oporność Streptococcus pneumoniae na

penicylinę I

i Wynika z obniżonego powinowactwa do białek wiążących penicylinę (PBP)

Geny kodujące zmienione PBP (geny mozaikowe) powstały w wyniku międzygatunkowego przekazania DNA (transformacja) i jego rekombinacji z DNA biorcy, głównie od Streptococcus mitis fPBP-2b, PBP-2XiPBP-1a) v'^: ••;

1a, 2b, 2x-oporność wysokiego stopnia na penicyliny i cefalosporyny

1a,2x- oporność na cefalosporyny przy zach. wrażliwości na penicylinę

2b-obniżona wrażliwość na penicyliny

Oporność Streptococcus pneumoniae

Zmiana białek wiążących penicylinę

- MIC>0,1 mg/ml • umiarkowana oporność na aminopenicyliny i cefalosporyny III generacji

i - MIC > 2 mg/ml • wysoka oporność na aminopenicyliny i cefalosporyny III generacji

i ■ Szczepy oporae na penicylinę to zazwyczaj szczepy wieloopome, które są równocześnie oporne na pozostałe p laktamy oraz na tetracykliny, makrolidy, linkozamidy, kotrimoksazol, chloramfenikol

Antybiogram minimum

i Streptococcus pneumoniae

oksacylina/metycylina

OX-R/I ox-s

MIC dla penicyliny i cefalosporyn oznaczenie wystarczającedo leczenia

Antybiogram minimum

i Staphylococcus sp.

metycylina (b laktamazy Nnkomycyna H + erytromycyna
1. MS, p lak(-), MLSB(-) 1	oznaczenie wystarczające do leczenia
2. MS, p lak(+), MLSB(-)	p laktamazooporne penicyliny +?
3. MS, p lak(-), MLSB(+)	Bez antybiogramu (nie stosować makrolidów)
4. MS, p lak(+), MLSB(+)	B laktamazooporne penicyliny +? nie stosować makrolidów)
5. MR, MLSB(-)	Pełny antybiogram bez p laktamów
6. MR, MLSB(+) Interpretacja wyniku badania mikrobiologicznego w zakresie wykrywania mechanizmów oporności Wykrycie p- laktamaz chromosomalnych (test cefinazowy) -oznacza oporność na penicyliny i cefalosporyny wrażliwe na S działanie p-laktamaz (amoksycylina, ampicylina, cefalotyna, cefuroksym) Wykrycie metycylinooporności gronkowcow MRS - oznacza, że szczep jest oporny na wszystkie antybiotyki p-laktamowe ■ Wykrycie p-laktamaz o rozszerzonym zakresie działania (ESBL) - ozanacza, że szczepy produkujące ESBL-e należy traktować jako oporne na wszystkie penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy i unikać w terapii tych leków. - Wykrycie MLSB - oporności dysocjacyjnej u gronkowcow i paciorkowców - oznacza oporność krzyżową na makrolidy, linkozamidy i streptograminy. Interpretacja wyniku badania mikrobiologicznego w zakresie wykrywania mechanizmów oporności Wykrycie oporności typu HLAR - enterokoki oporne na wysokie stężenia aminoglikozydów (120 ^g - G,, 300 fig- Sr) oznacza oporność na aminoglikozydy i jednocześnie brak możliwości stosowania aminoglikozydów w terapii skojarzonej. Wykrycie p laktamaz indukcyjnych • ograniczenie stosowania antybiotyków p-laktamowych będących dobrymi induktorami p laktamaz (cefalosporyny III generacji, karbapenemy) Wykrycie MLB - metaloenzymy chromosomalne - enzymatyczna oporność na karbapenemy Oporność na glikopeptydy enterokoków GRE i VRE i gronkowców GISA lub VISA średnia wrażliwość na wankomycynę - zakaz stosowania wankomycyny w terapii. Oporność na glikopeptydy wśród gronkowców-VRSA-alarm I OBRAZEK IMG_4419 OBRAZEK IMG_4422 owoczesne laboratorium i Standaryzacja badań i Wewnętrzna i zewnętrzna kontrola jakości badań WPROWAEDZONY SYSTEM JAKOSCI, CERTYFIKATY, AKREDYTACJA i Oznaczenie drobnoustrojów co najmniej do poziomu gatunku na podstawie: • cech f enot y powych -metabolizmu • specyfiki antygenowej • serologii ■ Wykonanie antybiogramu z uwzględnieniem: - wzorów oporności - wykrywania mechanizmów oporności - określania MIC IMBC Możliwość wykorzystywania nowoczesnych metod genetycznych i molekularnych w dochodzeniach epidemiologicznych Nowoczesne laboratorium cd i Wykształcenie i doświadczenie zespołu mikrobiologicznego i Bezpośredni kontakt pracowników laboratorium z zespołem terapeutycznym - ocena jakości pobranego materiału - klasyfikacja drobnoustroju: patogen/ czynnik kolonizujący - określenie doboru antybiotyków do profilaktyki i leczenia i Okresowe raporty laboratorium mikrobiologicznego analizowane przez zespół ds. kontroli zakażeń ■ zmiany we florze bakteryjnej alert - zmiany we wzorach oporności patogen Zadania laboratorium w zakresie badań mikrobiologicznych i współpracy z zespołem zakażeń szpitalnych Określić czynnik etiologiczny zakażenia - zastosować terapię całowaną Znajomość najczęściej występujących czynników etiologicznych zakażeń Znajomość flory kolonizującej pacjenta (potencjalne czynniki etiologiczne zakażeń szpitalnych) Określić specyfikę oddziału i bakterie występujące w środowisku szpitalnym Określić lekooporność bakterii występujących w środowisku szpitalnym > Poznać mechanizmy oporności bakterii w danym szpitalu - ocenić zagrożenia Opracować zasady terapii empirycznej i profilaktyki okołooperacyjnej Zakażenia szpitalne (narzędzia) Badania bakteriologiczne - izolacja drobnoustroju - Identyfikacja drobnoustroju - określenie wzoru oporności Dochodzenie epidemiologiczne - Biotypla - Fagotypia - Bakteriocynorypia - nowoczesne techniki molekularne (sondy genetyczne, PCR, LCR) Pracowniia mikrobiologiczna jako zrodlo informacji Obraz mikrobiologiczny oddzialu(szpitala) klasyfikacja zakażenia rodzaj, gatunek, typ czynnika etiologicznego spektrum wrażliwości na antybiotyki źródła, rezerwuary drobnoustrojów drogi przenoszenia (transmisja) Antybiotyki skuteczność leków przeciwbakteryjnych in vitro zmiana wzorów oporności Sterylizacja i dezynfekcja - ocena $ku tuczności Zastosowanie metod molekularnych i Do określenia rodzaju drobnoustroju (sondy) i Do identyfikacji gatunku i szczepu (sonda,PCR) i Do oznaczanie genów oporności - sondy DNA - PCR (RT-PCR) -LTR -bDNA - Sekwencjonowanłe - ogniskowanie Izoelektryczne Zastosowame metod momuiarnych cd. - bONA- rozgałęzione sondy znakowane enzymem wzmocnienie sygnału - RT-PCR - Ilość RNA w badanej próbie określa się na podstawie ilości syntetycznego standardu biorącego równolegle udział w reakcji - QC-PCR -metoda ilościowi kompetycyjna - ocena Ilości badanego RNA podobnie jak w met RT-PCR; standard współzawodniczy z próbą o miejsce wiążące enzymu. - NAS BA -powielanie oparte na sekwencji kw. nukleinowego, ocena ilości podobnie jak w RT-PCR, z użyciem trzech standardów. NIE MOGĘ SIĘ ROZCZYTAC IMG_4432	Pełny antybiogram bez p laktamów i mat ml innu/

---