2906542621

252 NOWE W BIOCHEMII

W. Arber był również jednym z pierwszych, którzy zapoczątkowali badania procesu restrykcji i modyfikacji in vitro. Wykazał on, że częściowo oczyszczony ekstrakt z E.coli B wykazuje właściwości enzymu restrykcyjnego (11) oraz enzymu modyfikującego, obu w stosunku do niemetylowanego DNA.

Na szczególne zainteresowanie zasługuje artykuł przeglądowy opublikowany przez Arberai Linna w 1969 roku (12). W artykule tym Arber nie tylko podsumował wiadomości dotyczące mechanizmu restrykcji i modyfikacji DNA, ale na ich podstawie przedstawił hipotezę dotyczącą rodzaju miejsc rozpoznawanych w DNA przez enzymy restrykcyjne i modyfikujące. Zakładając, że to samo miejsce powinno być rozpoznawane przez oba typy enzymów oraz, że nie powinno ono obejmować odcinków dłuższych niż 6—8 par zasad Arber zaproponował trzy różne modele sekwencji zasad w miejscu rozpoznawanym. Modele te, w zasadzie, różniły się obecnością lub brakiem symetrii w sekwencji zasad. Przypuszczenia te znalazły w następnych latach potwierdzenie w wynikach eksperymentalnych.

Pierwszym wyizolowanym i oczyszczonym enzymem restrykcyjnym była endo-nukleaza wydzielona w 1968 roku z E.coli K (13). Kofaktorami reakcji katalizowanej przez ten enzym są S-adenozylometionina, ATP i Mg++. Enzym ten, chociaż rozpoznaje określoną sekwencję zasad, to nacina cząsteczkę DNA w dowolnym miejscu. W wyniku działania endonukleazy K powstaje zatem heterogenna populacja fragmentów cząsteczek DNA, o różnej długości. Z tych względów enzym ten nie nadaje się do analitycznego badania struktury DNA.

W 1970 roku ukazały się dwie publikacje H. Smitha i współpracowników. W pierwszej z nich (14) opisany został enzym restrykcyjny wyizolowany z Haemo-philus influenzae Rd. Enzym ten, endonukleaza, wymagał do swego działania jedynie obecności jonów Mg++ i wprowadzał ograniczoną ilość cięć w dwuniciowej cząsteczce niezmodyfikowanego DNA. W kolejnej pracy (15) określono sekwencję zasad rozpoznawaną przez ten enzym i co najważniejsze, wykazano, że przecięcie nici DNA następuje również w zakresie tej sekwencji, co prowadzi do powstania kilku produktów, każdy z nich składa się z fragmentów cząsteczek DNA o tej samej długości. Prace H. Smitha zapoczątkowały poszukiwania podobnych enzymów w innych gatunkach bakterii i doprowadziły liczbę poznanych obecnie enzymów restrykcyjnych do ponad 120.

Enzymy restrykcyjne podobne do odkrytego i opisanego enzymu przez Smitha i współpracowników mogą być użyte do konstrukcji fizycznych map różnorodnych genomów. Myśl ta podjęta została i rozwinięta przez Daniela Nathansa (16), który wykazał, że DNA wirusa SV40 jest cięty przez endonukleazę Hind II na 5 fragmentów, przez endonukleazę Hind III na 6 fragmentów, a przez endonukleazę Hpa I na 3 fragmenty. Biorąc pod uwagę znany uprzednio fakt, że ten sam DNA jest cięty tylko raz przez endonukleazę Eco RI można było ustalić wzajemne położenie fragemntów DNA otrzymanych po działaniu Hind II, Hind III i Hpa I, a tym samym skonstruować mapę fizyczną DNA tego wirusa. Metoda ta okazała się szczególnie przydatną do określenia map fizycznych genomów takich organizmów u których nie można tego wykonać wykorzystując klasyczną metodę rekombinacji genów. Prace Nathansa zapoczątkowały serię późniejszych publikacji, w których wykorzystano enzymy restrykcyjne do konstrukcji map fizycznych różnych cząsteczek DNA (17).

Prace trzech badaczy uhonorowanych tegoroczną nagrodą Nobla doprowadziły nie tylko do poznania i wyjaśnienia zjawiska restrykcji i modyfikacji DNA, lecz dały również biologom narzędzie do badań o znaczeniu zarówno podstawowym, jak i mogącym doprowadzić do znaczących zastosowań praktycznych.

Andrzej Piekarowicz