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292 6ćmes J. Scientifigues du Rćseau Biotechnologies Yćgetales AUPELF.UREF, Orsay, juillet 1997

de terre. Le partenaire sauvage de fusion a ete choisi parmi les clones les plus resistants de S. tarijense suitę a des tests de resistance in vitro en utilisant le filtrat brut de culture du champignon.

MATERIEL ET METHODES Materiel vegetal

Un clone dihaploide de pomme de terre, var. Cardinal a tubercules a peau rouge (2n = 2x = 24 chromosomes), et un clone resistant d’une espece sauvage apparentee tuberifere et diploide, Solarium tarijense (2n = 2x = 24 chromosomes), ont ete multiplies par repiąuages successifs in vitro de noeuds selon la methode de Chaput et al. (1990).

Isolement de protoplastes et regeneration de plantes

Le protocole d’isolement de protoplastes et de regeneration de plantes a ete precedemment decrit (Chaput et al. 1990). Des mesophylles preleves sur des plantes in vitro agees de 3-4 semaines ont ete scarifies et mis en incubation dans une solution enzymatique composee de sels mineraux (Frearson et al. 1973), de 0.5 % (m/v) de Cellulase RS, de 0,05 % (m/v) de Pectolyase Y23 et de 0,5 M de mannitol, le pH etant ajuste a 5,5. Apres une periode de digestion de 16 h a 27°C et a 1’obscurite, les protoplastes ont ete purifies et rinces respectivement dans une solution de saccharose a 21 % (m/v), et une solution de rinęage contenant 0,5 M de mannitol et 0,5 mM de

CaCh-

Les protoplastes fusionnes ont ete cultives dans le milieu liquide VKM (Binding et al. 1978) additionne de 250 mg/1 de polyethylene glycol (PEG), de 0,2 mg/l d‘acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4-D), de 0,5 mg/1 de zeatine et de 1 mg/l d'acide a-naphthaleneacetique (ANA). La pression osmotique est assuree par 1’ajout de 0,18 M de glucose et de 0,18 M de mannitol.

Les cals suffisamment developpes ont ete repiques dans le milieu de regeneration MS (Murashige et Skoog 1962) contenant notamment 2 mg/1 de zeatine et 0,1 mg/l d'acide indole-3-acetique (AIA).

Protocole d’electro fusion

L’appareillage d’electrofusion et le protocole de fusion ont ete precedemment decrits (Sihachakr et al. 1988). Brievement, la chambre de fusion, constituee d’electrodes paralleles, est placee au fond d’une boite de petri (15 x 50 mm) contenant environ 600-700 pi d’un melange, a parties egales, de protoplastes des deux parents. La densite des suspensions de protoplastes est ajustee a 4 x !0⁵ protoplastes/ml. L’application d^!un courant sinusoi'dal de haute frequence (1 MHz) pendant 15 s provoque 1’alignement des protoplastes, assurant ainsi le contact membranaire necessaire a la fusion cellulaire. La fusion est realisee a la suitę de 1’application de 1-2 impulsions d’un champ electrique d’une amplitudę de 1,2 KV/cm, pendant 40 ps chacune.

Tests de resistance in vitro a partir de filtrats bruts et en serre contrólee

Des clones de S. tarijense ont ete testes pour la resistance au filtrat brut du champignon selon la methode precedemment decrite (Jadari et al. 1992). Des boutures nodales comportant un noeud et la feuille axillaire ont ete repiquees dans des tubes a essais contenant 20 ml de milieu solide MS. Apres 3 semaines de culture. on ajoute dans chaąue tubę 1 ml d’une solution constituee de 50 % d’eau sterile ou de filtrat brut du champignon.