Enzymologia

Notatki z wykładów prof. W. Jarmuszkiewicz i prof. H. Kmity, wersja 1.3 (17.05.2009)

Wykład 1 – 03.03.2009

Enzymy sprawują kontrolę nad metabolizmem komórki. Metabolizm wymaga

skoordynowanego działania enzymów. Enzymy wzmacniają reaktywność reakcji chemicznej
(dzięki czemu część reakcji może zachodzić w temperaturze komórki) oraz zapewniają

precyzyjną kontrolę metabolizmu.

Enzymy są zestawione w szlaki bądź cykle, co zapewnia ich skoordynowane działanie.

Skoordynowane działanie enzymów jest także możliwe dzięki kontaktom miedzy szlakami i
cyklami enzymatycznymi. Reakcje enzymatyczne są połączone w ciągi: produkt jednej reakcji

jest substratem drugiej.

Szlaki i cykle enzymatyczne zawierają punkty kontrolne (enzymy kluczowe), decydujące o ich
przebiegu.

Fosfofruktokinaza (kluczowy enzym glikolizy):

fruktozo-6-fosforan + ATP → fruktozo-1,6-bisfosforan + ADP + H

+

symulowana jest przez AMP, ADP, hamowana przez ATP, cytrynian.

Enzymy kluczowe są białkami allosterycznymi. Białko allosteryczne dostosowuje swoje

działanie do sytuacji zewnętrznej, czyli reaguje na informacje w postaci oddziałujących z nimi
cząsteczek. Cechą charakterystyczną działania białka allosterycznego jest kooperatywność,

tzn. współdziałanie tworzących je podjednostek, co zapewnia zwiększoną skuteczność tego
działania.

Istotą katalizy enzymatycznej jest specyficzne wiązanie stanu przejściowego. Pierwszym

etapem katalizy enzymatycznej jest utworzenie kompleksu enzym-substrat (ES). Substraty
wiążą się w miejscu aktywnym enzymu w określonej, korzystnej orientacji przestrzennej.

Zwykle substraty wiązane są w sposób silnie selektywny, co ma wpływ na katalityczną
specyficzność enzymów.

Enzymy przyspieszają reakcję ponad milionkrotnie.

Anhydraza węglanowa – jest jednym z najszybszych enzymów:

CO

2

+ H

2

0 ↔ O=C-(OH)

2

Enzymy charakteryzuje duża specyficzność pod względem:

1

–

katalizowanej reakcji chemicznej,

–

substratów.

W reakcjach katalizowanych przez enzymy rzadko występują reakcje uboczne prowadzące do

powstania zbędnych produktów.

Katalizowanie reakcji przez enzymy prowadzi do wytworzenia stanów przejściowych o
najwyższej energii. Stabilizacja stanów przejściowych jest istotą katalizy enzymatycznej.

Specyficzność substratowa i specyficzność reakcji.

Enzymy proteolityczne prowadzą:

- proteolizę, czyli hydrolizę wiązania peptydowego:

Peptyd +H20 ↔ komponent karboksylowy + komponent aminowy

- oraz zwykle także hydrolizę wiązania estrowego:

Ester + H20 ↔ kwas + alkohol

Specyficzność enzymów proteolitycznych:
Trypsyna (enzym trawienny) rozcina wiązanie peptydowe po karboksylowej stronie reszt

argininy i lizyny.
Trombina (uczestnicząca w krzepnięciu krwi) rozcina tylko wiązanie Arg-Gly.

Bakteryjna subtylizyna nie rozróżnia bocznych łańcuchów aminokwasowych sąsiadujących z

hydrolizowanym wiązaniem (najmniej specyficzny enzym proteolityczny).

Polimeraza DNA I to przykład enzymu o wysokiej specyficzności. Polimeraza „myli się”
rzadziej niż raz na milion operacji.

Specyficzność enzymu wynika z precyzyjnej interakcji substratu z enzymem, co z kolei jest
wynikiem odpowiedniej struktury trójwymiarowej enzymu.

Aktywność wielu enzymów wymaga kofaktorów.

Apoenzym + kofaktor = holoenzym

Kofaktory enzymów:

–

koenzym – kofaktor będący małą cząsteczką organiczną,

–

grupa prostetyczna – koenzym silnie związany z enzymem,

–

„kosubstrat” – koenzym luźno związany z enzymem.

kofaktor (koenzym/metal)

enzym

pirofosforan tiaminy

dehydrogenaza pirogronianowa

2

nukleotyd flawinoadeninowy

monooksydaza aminowa

Zn

2+

anhydraza węglanowa

Zn

2+

karbkoskypeptydaza

Mg

2+

EcoRV

dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy

dehydrogenaza mleczanowa

fosforan pirydoksalu

fosforylaza glikogenowa

Mg

2+

heksokinaza

Enzymy przekształcają z dużą wydajnością jedną formę energii w drugą:

–

zamiana energii świetlnej na energię wiązań chemicznych z wytworzeniem gradientu

jonów w czasie fotosyntezy,

–

zamiana energii chemicznej cząsteczek pożywienia na energię gradientu jonowego a

następnie energię wiązania chemicznego ATP – w mitochondriach,

–

zamiana energii chemicznej ATP na energię mechaniczną w mięśniu (miozyna),

–

„zamiana” energii chemicznej ATP na wytworzenie gradientu jonowego – pompy
błonowe.

Molekularne mechanizmy działania enzymów poznajemy dzięki mikrografii rentgenowskiej

ujawniającej szczegóły struktury 3D.

ATPaza-Ca

2+

używa energii hydrolizy ATP do transportu Ca

2+

w poprzek błony komórkowej,

wytwarzając gradient jonów Ca2

+

.

Nazwa enzymu zwykle pochodzi od jego substratu lub katalizowanej reakcji (końcówka –

aza). Są też nazwy potoczne.

Klasyfikacja enzymów oparta jest na typie przeprowadzanej reakcji.

6 głównych klas enzymów:

klasa

typ reakcji

Przykład

1. Oksydoreduktazy

Utlenianie-redukcja

Dehydrogenaza mleczanowa

2. Transferazy

Przenoszenie grup

Kinaza nukleozydomo-

nofosforanowa (kinaza NMP)

3. Hydrolazy

Reakcje hydrolizy

(przenoszenie grup

funkcyjnych na cząsteczki

wody)

Chymotrypsyna

4. Liazy

Utworzenie wiązań

podwójnych poprzez dodanie

lub usunięcie grup

Fumaraza

3

5. Izomerazy

Izomeryzacja

(wewnątrzcząsteczkowe

przeniesienie grup)

Izomeraza triozofosforanowa

6. Ligazy

Ligacja (połączenie) dwóch

substratów na koszt hydrolizy

ATP

Syntetaza aminoacylo-tRNA

Przykład:

ATP + NMP ↔ ADP + NDP

Nazwa potoczna – kinaza NMP = kinaza nukleozydomonofosforanowa.
Oznaczenie numerowe – EC 2.7.4.4 (1. liczba – klasa, druga – przenoszona grupa

(fosforanowa), trzecia – akceptor (fosforan), czwarta – jeszcze bardziej specyficzna).

I zasada termodynamiki – zasada zachowania energii – w każdym procesie suma energii
układu i otoczenia pozostaje stała. Energia nie może być tworzona lub niszczona; może być

tylko przekształcana.

II zasada termodynamiki – wszystkie procesy przebiegają w takim samym kierunku, aby
następował sumaryczny wzrost entropii wszechświata, aż do ustalenia się stanu równowagi.

Każdy układ dąży do stanu maksymalnego nieuporządkowania (entropii).

Energia swobodna (Gibbsa, G) – funkcja termodynamiczna wiążąca pierwszą i drugą zasadę
termodynamiki – jest użyteczną funkcją dla zrozumienia działania enzymów.

ΔG = ΔH – TΔS

Gdzie:

- ΔG – zmiana swobodnej energii układu podczas przemiany przy stałej temperaturze (T) i
ciśnieniu (p).

- ΔH – zmiana entalpii tego układu
- ΔS – zmiana jego entropii.

Ponieważ:

- ΔH = ΔE + pΔV,

Gdzie:

- ΔE – zmiana wewnętrznej energii,
- ΔV – zmiana objętości (zwykle bardzo mała)

Stąd:

ΔG = ΔE – tΔS

4

A zatem ΔG zależy zarówno od zmiany energii wewnętrznej, jak i od zmiany entropii układu.
ΔG dostarcza informacji o spontaniczności reakcji, a nie o jej szybkości:

ΔG = 0 – układ w stanie równowagi, brak zmian

ΔG < 0 – wartość ujemna – reakcja może zajść spontanicznie, reakcja egzoergiczna
ΔG > 0 – wartość dodatnia – reakcja nie może zajść spontanicznie, reakcja endoergiczna

ΔG reakcji zależy jedynie od ΔG produktów (stanu końcowego) i substratów (stanu

początkowego). ΔG reakcji nie zależy od drogi przemiany czy molekularnego mechanizmu
przemiany. ΔG reakcji nie daje informacji o szybkości reakcji.

Enzymy nie wpływają na ΔG reakcji.

Enzymy wpływają na energię wymaganą dla zapoczątkowania reakcji (czyli swobodną

energię aktywacji, ΔG

‡

), która określa szybkość reakcji.

Jednostki energii:

Dżul (J) jest ilością energii potrzebną do użycia siły 1 N przez odległość 1 m.
Kilodżul (kJ) równa się 1000 J.

Kaloria (cal) jest równoważna ilości ciepła potrzebnego do podwyższenia temperatury 1
grama wody z 14,5⁰C do 15,5⁰C.

Kilokaloria (kcal) równa się 1000 cal.

1 kcal = 4,184 kJ
1 kJ = 0,239 kcal

Wyznaczanie ΔG reakcji (aby określić spontaniczność reakcji):

A+B ↔ C+D

ΔG = ΔG⁰ + RT ln

[

C ][ D]

[

A][ B]

R – stała gazowa, T – temperatura absolutna ([K]), [A], [B] – molowe stężenia (aktywności)

składników reakcji, ΔG⁰ – standardowa ΔG, gdy stężenia A, B, C, D równe są 1 M, a warunki
gazowe – 1 atmosferze.

A zatem, ΔG zależy od właściwości substancji reagujących (ΔG⁰) i od ich stężeń.

Dla ułatwienia przyjęto, że pH 7 to wartość standardowa.

ΔG⁰ ' to ΔG⁰ w pH 7 – zmiana standardowej energii swobodnej w pH 7.

ΔG⁰ jest związana ze stałą równowagi K

eq

.

5

W stanie równowagi ΔG = 0

0 = ΔG⁰' + RT ln

[

C ][ D]

[

A][B ]

ΔG⁰' = - RT ln

[

C ][ D]

[

A][B ]

Stała równowagi w warunkach standardowych K’

eq

jest równa:

K’

eq

=

[

C ][ D]

[

A][B ]

Podstawiając powyższy wzór do jeszcze wyższego:

ΔG⁰' = - RT ln K’

eq

ΔG⁰' = - 2,303 RT log

10

K’

eq

K’

eq

= 10

−

ΔG

⁰ '

2,303 RT

Podstawiając R = 8,28 x 10

-3

kJ mol

-1

deg

-1

oraz T=298 K (25⁰C)

K’

eq

= 10

−

ΔG

⁰ '

5,69

Zależność między ΔG⁰' i K’

eq

(w 25⁰C): im większa K’

eq

tym mniejsza ΔG⁰' (standardowa

zmiana energii swobodnej).

K’

eq

ΔG⁰ w [kJ/mol]

ΔG⁰ w [kcal/mol]

1

0

0

10

-1

5,69

1,36

10

-5,69

-1,36

Przykład obliczenia ΔG⁰ i ΔG⁰’ dla reakcji izomeryzacji DHAP do GAP:

W stanie równowagi stosunek [GAP]/[DHAP] = 0,0475 w 298 K (25⁰C) i pH 7, stąd K’

eq

=

0,0475.

ΔG⁰' = - 2,303 RT log

10

K’

Eq

ΔG⁰' = - 2,303 x 1,987 x 10

-3

x 298 x log

10

0,0475

ΔG⁰' = 1,80 kcal/mol (7,53 kJ/mol)

Jest to więc reakcja endoergiczna, która nie zajdzie spontanicznie w warunkach równowagi.

6

Gdy zmienimy stosunek [GAP]/[DHAP] do wartości 0,015 (na korzyść substratu), to ΔG reakcji

obliczona wg wzoru wyniesie:

ΔG = ΔG⁰ + RT ln

[

C ][ D]

[

A][ B]

ΔG = 1,80 kcal/mol + 2,303 RT log

10

3 x 10

−

6

M

2 x 10

−

4

M

= 1,80 kcal/mol – 2,49 kcal/mol =

= - 0,69 kcal/mol (- 2,89 kJ/mol)

W tym przypadku reakcja zajdzie spontanicznie, gdyż jest reakcją egzoergiczną.

ΔG może być większa, mniejsza lub równa ΔG⁰’ – zależnie od stężenia składników reakcji. Ma
to znaczenie w szlakach metabolicznych, gdy dla danej reakcji ΔG⁰’ > 0. Wówczas poprzez

dostosowanie stężenia substratów i produktów reakcja taka może stać się reakcją
spontaniczną. Na tej zasadzie opiera się sprzężenie reakcji tworzących szlaki metaboliczne.

Enzymy zmieniają szybkość reakcji nie mając wpływu na stan równowagi reakcji, tzn.

enzym zwiększa w tym samym stopniu szybkość reakcji zachodzącej w obu kierunkach

Dla przykładowej reakcji A ↔ B, gdzie dla A → B:

–

k

F

= stała szybkości Recka do przodu = 10

-4

/s,

–

k

R

= do tyłu = 10

-6

/s.

k

F

/k

R

daje stałą równowagi reakcji:

K =

[

B]

[

A]

=

k

F

k

R

=

10

−

4

10

−

6

=

100

Czyli niezależnie od obecności enzymu stała równowagi z tej reakcji jest zawsze równa 100.

Wnioski: enzym nie przesuwa stanu równowagi, tylko przyspiesza jego osiągnięcie.

Stan równowagi reakcji jest jedynie funkcją różnicy energii swobodnej między substratami a
produktami.

Wykład 2 – 10.03.2009

Enzymy przyspieszają reakcję ułatwiając tworzenie stanu przejściowego.

Stan przejściowy (S‡) ma energię wyższą zarówno od energii substratu (S) i produktu (P),

stąd jest najrzadziej występującym stanem w całym przebiegu reakcji.

7

Swobodna energia aktywacji Gibbsa (energia aktywacji, ΔG

‡

) jest różnicą energii swobodnej

między stanem przejściowym a substratem.

ΔG = G

S‡

– G

S

Enzymy przyspieszają reakcję obniżając energię aktywacji (ΔG

‡

) czyli ułatwiając tworzenie

stanu przejściowego. ΔG pozostaje bez zmian.

[rysunek: wykres wolnej energii od postępu reakcji]

Załóżmy, że stan przejściowy (S‡) i substrat (S) są w równowadze.

K‡ - stała równowagi dla tworzenia S‡

V – szybkość tworzenia P z S‡.

Szybkość reakcji ~ [S‡]

Ponieważ tylko S‡ (a nie S) może być przekształcony w produkt.

Im większa różnica między energią swobodną S i energią swobodną S‡, tym mniejsza ilość
cząsteczek w stanie S‡.

Ponieważ szybkość reakcji ~[S‡], które z kolei zależy od energii aktywacji (ΔG

‡

) to szybkość

reakcji (V) zależy od ΔG

‡

.

Stosunkowo niewielkie obniżenie ΔG

‡

(o 5,69 kJ/mol) daje znaczny (10x) wzrost V.

Niższa ΔG

‡

(niższa bariera aktywacji) oznacza, że więcej cząsteczek posiada energię

wymaganą dla osiągnięcia S‡.

Istotą katalizy enzymatycznej jest specyficzne wiązanie i stabilizacja stanu przejściowego,

który na drodze reakcji chemicznej jest stanem o najwyższej energii.

Intermediaty (związki pośrednie) (intermediates) – posiadają chemiczny czas życia dłuższy
niż wibracja cząsteczki, czyli >10

-13

s. Nawet jeśli S i P są stabilnymi cząsteczkami

chemicznymi, intermediaty (ES i EP) występują, przyjmując niskie wartości ΔG w diagramie
współrzędnych reakcji. Mniej stabilne intermediaty występują tylko podczas reakcji

katalizowanej przez enzym.
Przekształcenie dwóch kolejnych intermediatów reakcji stanowi etap reakcji (reaction step).

W reakcji złożonej z kilku etapów, szybkość całkowita zależy od etapu (lub etapów) o
największej energii aktywacji, tzw. etapu ograniczającego reakcję (rate limiting step).

8

E+S ↔ ES ↔ EP ↔ E+P

[obrazek: wykres Free energy od Reaction coordinate z zazn. Transition state]

Energia aktywacji jest barierą energetyczną dla reakcji chemicznych. Bariery te są istotne dla
życia: bez barier energetycznych, złożone makrocząsteczki spontanicznie zamieniane byłyby

do prostszych, a złożone i wysoce uporządkowane struktury metaboliczne nie mogłyby
istnieć.

W trakcie ewolucji enzymy „rozwinęły” niższą energię aktywacji selektywnie dla reakcji
koniecznych dla przeżycia komórki.

Zasady badań enzymatycznych i kinetycznych.

Aktywność enzymu mierzymy oznaczając szybkość tworzenia P reakcji lub szybkość

zużywania S.
Wybór techniki pomiaru zależy od dostępności aparatury, odczynników, wymaganego

poziomu czułości, itd.

Podstawowe źródła literaturowe dotyczące metod badania aktywności poszczególnych
enzymów to:

- „Methods In Enzymology”
- „Methods In Enzymatic Analysis”

Krzywe przebiegu reakcji – uwagi praktyczne

Przyczyny zwolnienia reakcji:

- Ograniczenie dostępności S,
- zbliżanie się do stanu równowagi,

- inhibicja przez P,
- niestabilność jednego z elementów reakcji (E/S),

- inhibicja E zależna od czasu (niestabilność E),
- artefakty metodyczne:

a) ograniczenia techniczne wykraczające poza linearność pomiaru (pomiary

spektrofotometryczne),

b) brak linearności w reakcjach wspomagających (w układach sprzężonych),

- zmiany warunków pomiarowych.

[P]

[czas]

9

Istotą katalizy jest specyficzne wiązanie stanu przejściowego. Pierwszym etapem katalizy
enzymatycznej jest utworzenie kompleksu enzym-substrat (ES). Substraty wiążą się w

miejscu aktywnym enzymu w określonej, korzystnej orientacji przestrzennej. Zwykle
substraty wiązane są w sposób silnie selektywny, co ma wpływ na katalityczną specyficzność

enzymów.

[obrazek: enzymatic catalysis of a reaction between two substrates]

Dowody na istnienie kompleksu ES:

1. Reakcja katalizowana enzymatycznie wykazuje szybkość maksymalną, czyli przy

odpowiednio dużym stężeniu substratu, wszystkie miejsca katalityczne zostają

obsadzone.

2. Krystalografia rentgenowska pozwoliła na otrzymanie obrazów (o dużej

rozdzielczości) przedstawiających kompleksy ES lub kompleksy analog substratu –
enzym.

3. Zmiana w charakterystyce spektralnej enzymu lub substratu wraz z utworzeniem

kompleksu ES. Intensywność fluorescencji grupy fosforanu pirydoksalu (grupy

prostetycznej), znajdującej się w miejscu aktywnym syntetazy tryptofanowej, ulega
zmianie po dodaniu substratów reakcji, czyli seryny i indolu.

Miejsce aktywne enzymu to obszar, który:

–

wytwarzając odpowiednią orientację przestrzenną specyficznie wiąże substraty (i
kofaktory), co sprzyja tworzeniu stanu przejściowego,

–

zawiera reszty AA (tzw. grupy katalityczne enzymu) biorące udział w tworzeniu i
zrywaniu wiązań,

–

bezpośrednio obniża energię aktywacji reakcji.

Cechy wspólne miejsc aktywnych enzymów:

1. Miejsce aktywne to trójwymiarowa szczelina utworzona przez grupy pochodzące z

różnych części sekwencji AA enzymu.

2. Miejsce aktywne zajmuje tylko stosunkowo małą część całkowitej objętości enzymu.

AA nie wchodzące w skład miejsca aktywnego tworzą: (często dopasowując się

przestrzennie) trójwymiarowe rusztowanie konieczne dla utworzenia miejsca
aktywnego, miejsca regulatorowe (miejsca wiążące aktywatory), miejsca

oddziaływania z innymi białkami, kanały, dzięki którym substraty docierają do miejsca
aktywnego.

3. Miejsca aktywne są hydrofobowymi zagłębieniami lub szczelinami. Miejsce wiążące S

znajduje się w szczelinie, która niedostępna jest dla cząsteczek wody. Niepolarny

(hydrofobowy) charakter szczeliny sprzyja wiązaniu S, a także katalizie. Czasami
szczelina zawiera specyficzne reszty polarne konieczne dla wiązania S i katalizy.

4. W miejscu aktywnym, wiele słabych niekowalencyjnych oddziaływań bierze udział w

wiązaniu S z E. Są to oddziaływania o energii swobodnej ok. 10-50 kJ/mol takie jak

oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, interakcje

10

hydrofobowe. Oddziaływania te wymuszają wysoki stopień specyficzności wiązania S
z E.

5. Specyficzność wiązania S z E zależy od precyzyjnie określonego ułożenia atomów w

miejscu aktywnym. Model klucza i zamka wiązania enzymu z substratem – w modelu

tym, kształt miejsca aktywnego enzymu jest komplementarny do kształtu substratu.
Model wymuszonego dopasowania wiązania enzymu z substratem – w modelu tym

wiązanie substratu pociąga za sobą zmianę kształtu enzymu. Kształt miejsca
aktywnego staje się komplementarny do kształtu substratu dopiero po związaniu

substratu.

Energia wiązania między enzymem a substratem – energia swobodna uwalniana podczas
wiązania E i S, a więc podczas tworzenia się licznych słabych oddziaływań między E i S.

Maksymalizacja energii wiązania jest odpowiedzialna za dużą specyficzność substratową
wykazywaną przez wiele enzymów. Do pełnego zestawienia tych oddziaływań dochodzi tylko

wtedy, gdy substrat jest w stanie przejściowym, a zatem, maksymalna energia wiązania jest
uwalniana gdy enzym ułatwia tworzenie stanu przejściowego.

Energia uwalniana podczas oddziaływań pomiędzy enzymem i substratem może być
traktowana jako obniżenie energii aktywacji.

Badanie szybkości reakcji chemicznych nazywamy kinetyką, a badanie szybkości reakcji
katalizowanych przez enzymy – kinetyką enzymatyczną. Kinetyczny opis aktywności

enzymów jest konieczny dla zrozumienia działania enzymów.

A → P – reakcja pierwszego rzędu
V = k[A], jednostka: k/s (k – stała szybkości reakcji)

A + B → P lub 2A → P – reakcja drugiego rzędu

V=k[A][B] lub V=k[A]

2

; jednostka k/(Ms)

Istnieją także reakcje pseudopierwszego rzędu (jeden z dwóch substratów w znacznym
nadmiarze, kinetyka zależy tylko od jednego) i reakcje zerowego rzędu (gdy szybkość reakcji

nie zależy od stężenia substratu).

1913 – opracowanie kinetycznego modelu działania enzymów: Leonor Michaelis, Maud
Menten.

Model Michaelisa-Menten opisuje właściwości kinetyczne wielu enzymów.

V

max

V

max

2

[S]

11

Wykres zależności szybkości reakcji V

o

od stężenia substratu [S] dla enzymu zachowującego

się zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten, pokazuje że osiągana szybkość jest maksymalna

(V

max

).

Przy stałym stężeniu E, V

o

jest prawie liniowo proporcjonalna do [S] przy małym [S], przy

dużym [S] V

o

jest prawie niezależna od [S].

Stała Michaelisa (K

M

) to stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji równa jest połowie

Vmax.
Szybkość katalizy (V

o

) to liczba moli produktu utworzonego w czasie 1 s.

Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji (V

o

).

V

o

produkt

[S4]

[S3]
[S2]

[S1]

czas

Ilość produktu tworzonego przy różnych stężeniach substratu jest wykreślona jako funkcja

czasu. Szybkość początkowa (V

o

) dla każdego stężenia substratu jest wyznaczona z

nachylenia krzywej na początku reakcji (przy małym stężeniu P), gdy reakcja odwrotna jest

jeszcze nieznaczna.

W stanie równowagi nie obserwujemy zmian netto [S] i [P].

Zmiany w stężeniu uczestników reakcji katalizowanej przez enzym jako funkcja czasu.

W warunkach stanu stacjonarnego stężenia intermediatów reakcji ([ES]) nie zmieniają się.
Zmienia się tylko [S] i [P], aż do osiągnięcia stanu równowagi, przeciwnie do stanu

przedstacjonarnego.

stężenie

stężenie

stan stacjonarny

czas

czas

Omówienie kinetycznego modelu Michealisa-Menten:

12

V

o

= k

2

[ES]

Szybkość tworzenia ES = k

1

[E] [S]

Szybkość rozpadu ES = (k

-1

+ k

2

) [ES]

W stanie stacjonarnym szybkość tworzenia ES = szybkości rozkładu ES.

k

1

[E][S] = (k

-1

+ k

2

) [ES]

[

E ][S ]
[

ES ]

=



k

−

1



k

2



k

1

Wprowadźmy nową stałą K

M

– stała Michaelisa

K

M

=

k

−

1



k

2

k

1

[

ES ]=

[

E ][S ]

K

M

Maksymalna szybkość reakcji (V

max

) jest uzyskana, gdy wszystkie miejsca katalityczne enzymu

są wysycone substratem, tzn. gdy [ES]=[E]

T

. Stąd:

Vmax = k

2

[E]

T

Równanie Michaelisa-Menten (dla reakcji z 1 substratem):

V

0

=

V

max

[

S ]

[

S ]K

M

Zależność V

0

od [S]:

Przy małym [S], gdy [S] jest znacznie mniejsze od K

M

, tzn. szybkość reakcji jest proporcjonalna

do S: V

0

=

V

max

K

M

[

S ]

.

Przy dużym [S], gdy [S] jest dużo większe od K

M

, tzn. osiągnięta została wartość V

max

, która

jest niezależna od [S], V

o

=V

max

.

13

Kiedy [S]=K

M

, wtedy V

0

=

V

max

2

.

Zatem K

M

jest równa stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę swojej

maksymalnej szybkości.

Znaczenie wartości K

M

:

Mała K

M

– enzym o dużym powinowactwie do substratu.

Duża K

M

– enzym o małym powinowactwie do substratu.

Fizjologiczne znaczenie K

M

:

–

fizjologiczna wrażliwość na aldehyd octowy wywołana defektem mitochondrialnej
dehydrogenazy aldehydu octowego o niskiej K

M

(w porównaniu z enzymem

cytozolowym):

CH

3

CH

2

OH + NAD

+

↔ (enzym: dehydrogenaza alkoholowa) CH

3

CHO + H

+

+ NADH (forma

cytozolowa – o dużym K

M

).

CH

3

CHO + NAD

+

→ (enzym: dehydrogenaza acetaldehydowa) CH

3

COO

-

+ NADH + 2 H

+

(forma

mitochondrialna – o małym K

M

).

Wartość K

M

danego enzymu zależy od substratu (może być różna dla różnych substratów

danego enzymu) oraz warunków zewnętrznych (temp., pH, siła jonowa). Przedział K

M

: 10

-1

–

10

-7

M

Wartość K

M

danego enzymu może być różna dla różnych substratów (V

max

pozostaje bez

zmian).

[E] wpływa na wartość V

max

ale nie na K

M

:

14

Określanie V

max

i K

M

przy użyciu wykresu odwrotności V

0

i [S]:

Równanie L-B: 1/Vo = 1/V

max

+ K

M

/V

max

* 1/[S]

Wykres odwrotności wartości V

0

i [S] czyli wykres Lineweavera-Burka.

Nachylenie prostej: K

M

/V

max

Przecięcie osi Y: 1/V

max

Przecięcie osi X = -1/K

M

Znajomość V

max

i K

M

danego enzymu jest użyteczna dla wielu celów biochemicznych:

–

oszacowania wewnątrzkomórkowych szybkości reakcji,

–

określenia metabolicznych punktów kontrolnych,

–

porównania izoenzymów z różnych tkanek i organów,

–

określenia molekularnych mechanizmów katalizy enzymatycznej,

–

określenia liczby obrotów,

–

ilościowego porównania różnych substratów,

–

określenia możliwości inhibitorów i aktywatorów.

Wykład 3 – 17.03.2009

15

Opóźnienie (lag) lub przejściowe przyspieszenie (burst) reakcji – przyczyny:

1. Artefakt pomiaru.

2. Niewłaściwa kontrola temperatury pomiaru a T1 + b T2 = (a + b + T3) gdzie a, b –

objętości składników reakcji, T1, T2 – temp. składników mieszaniny, T3 – temp.

pomiaru.

3. Osadzanie nierozpuszczalnych elementów.

4. Wolna odpowiedź detektora
5. Powolna dysocjacja od E odwracalnego inhibitora lub aktywatora.

6. Szybkość osiągania wartości stanu stacjonarnego przez [ES] i [EP].
7. Hamowanie lub aktywacja E przez duże [S].

8. Aktywacja przez P.
9. Wzajemne przekształcenia izoform S.

10. Efekty histeretyczne – zależność układu od wcześniejszego stanu (stanu preinkubacji

składników reakcji)

PROBLEMY PRAKTYCZNE

Ponieważ nie zawsze wszystkie S reakcji są w stężeniu wysycającym, prawdziwa K

M

i

prawdziwa V

max

różnią się na ogół od mierzonej K

M

i mierzonej V

max

.

V

0

=

V

max

[

S ]

[

S ]K

M

Przed doświadczeniem mającym na celu oznaczenie K

M

i V

max

danej reakcji należy ustalić

optymalne warunki reakcji tj. pH, temperaturę, siłę jonową, stężenie kationów (zwykle Mg

2+

i

[K

+

] są istotne), itp.

Celem jest uzyskanie jak największej szybkości reakcji przy najmniejszym [E] wymaganym
do detekcji szybkości reakcji (pamiętając, że E musi być stabilny podczas całego czasu

pomiaru).

Znaczenie wartości K

M

:

K

M

oznacza stężenie S, przy którym połowa miejsc aktywnych jest obsadzona, a więc stanowi

miarę [S] wymaganego do osiągnięcia znaczącej katalizy. Dla wielu enzymów K

M

= stężeniu

substratu in vivo.

Ułamek miejsc obsadzonych przez S: (gdy znamy K

M

dla każdego S); f

ES

= V/V

max

= [S] + K

M

K

M

jest związany ze stałymi szybkości reakcji:

k

1

: stała S → ES

k

-1

: stała ES → S

k

2

: stała ES → E+P

16

K

M

=

k

−

1



k

2

k

1

Gdy k

-1

>> k

2

:

K

M

=

k

−

1

k

1

Stała dysocjacji kompleksu ES wynosi:

K

ES

=

[

E ][ S ]
[

ES ]

=

k

−

1

k

1

=

K

M

To K

M

równa się stałej dysocjacji kompleksu ES i w tych warunkach określa siłę kompleksu ES,

tzn. mała K

M

oznacza silne wiązanie kompleksu ES i odwrotnie.

Znaczenie wartości V

max

:

V

max

ujawnia liczbę obrotów enzymu czyli liczbę cząsteczek S przekształconych w P przez

cząsteczkę enzymu na jednostkę czasu, w warunkach pełnego wysycenia enzymu
substratem.

V

max

= k

2

[E]

T

[E]

T

– stężenie miejsc aktywnych

k

2

= k

kat

= liczba obrotów enzymu

k

2

=

V

max

[

E ]

T

Przykład: anhydraza węglanowa – enzym o największej znanej liczbie obrotów.

10

-6

M roztworu enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem katalizuje tworzenie

0,6 M H

2

CO

3

na sekundę.

A więc k

2

= liczba obrotów = 0,6/10

-6

[M/s/M] = 600000/s.

Stąd, cykl katalizy = 1/k

2

– 1,7 μs.

Zwykle liczba obrotów enzymów in vivo wynosi 1-10

4

/s.

Gdy enzym wysycony jest S, tzn. gdy [S] >> K

M

, to szybkość katalizy = k

2

= k

kat

= liczbie

obrotów.

Zwykle jednak, w warunkach fizjologicznych:
[S]/Km = 0,01 – 1,0 stąd większość enzymów nie jest wysycona substratem,

[S] << K

M

i szybkość katalizy << k

kat

(liczby obrotów), gdyż większość miejsc aktywnych

enzymu nie jest zajęta.

17

W warunkach, gdy [S] << K

M

, kinetykę enzymu charakteryzuje wielkość k

kat

/K

M

, czyli szybkość

katalizy zależy od k

kat

/K

M

.

Poprzez połączenie poprzednich równań otrzymamy:

V

0

= k

2

[ES]; [ES] = [E][S]/ K

M

daje:

V

0

=

k

kat

K

M

[

E][S ]

Gdy [S] << K

M

, to [E] = [E]

T

, stąd:

V

0

=

k

kat

K

M



[

E ][S ]

k

kat

/K

M

jest stałą szybkości oddziaływania S i E oraz miarą wydajności katalitycznej.

Porównując wartości k

kat

/K

M

możemy porównać preferencje enzymu do różnych substratów,

np. chymotrypsyna preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych znajdujących się obok
rozbudowanych hydrofobowych łańcuchów bocznych

Ograniczenia wydajności enzymów czyli wartości k

kat

/K

M

:

k

kat

K

M

=

k

kat



k

−

1



k

kat



k

1

=

k

kat



k

kat



k

−

1



k

1



k

1

Załóżmy, że k

kat

>> k

-1

, wtedy k

kat

/K

M

zbliża się do wartości k

1

, czyli szybkości tworzenia ES. Tak

więc górna granica k

kat

/K

M

narzucona jest przez k

1

.

Stąd szybkość tworzenia ES nie może być większa niż kontrolowana przez dyfuzję szybkość
(częstotliwość), z jaką spotykają się S i E.

Dyfuzja ogranicza k

1

, stąd k

1

nie może być większa niż 10

8

-10

9

/s/M. co stanowi też górną

granicę k

kat

/K

M

.

Enzymy, które osiągnęły perfekcję kinetyczną, to enzymy, dla których stosunek k

kat

/K

M

jest

bliski kontrolowanej przez dyfuzję szybkości spotykania się enzymów z substratami (czyli

wynosi 10

8

-10

9

/s/M).

18

Szybkość katalityczna tych enzymów ograniczona jest wyłącznie szybkością ich spotykania się
z substratami w roztworze. Dla nich dalszy wzrost k

kat

można uzyskać tylko przez skrócenie

czasu potrzebnego do dyfuzji.
Tutaj każde spotkanie E z S jest produktywne, stąd mogą istnieć siły elektrostatyczne

ściągające S do miejsca aktywnego – efekt Kirke, tak by skrócić czas potrzebny na dyfuzję S
do E.

Enzym

k

kat

/K

M

[/s/M]

Esteraza acetylocholinowa

1,6 x 10

8

Anhydraza węglanowa

8,3 x 10

7

Katalaza

4 x 10

7

Krotonaza

2,8 x 10

8

Fumaraza

1,6 x 10

8

Izomeraza triozofosforanowa

2,4 x 10

8

β-laktamaza

10

8

Dysmutaza ponadtlenkowa

7 x 10

9

Ograniczenie narzucone przez szybkość dyfuzji w roztworze może być częściowo pokonane

przez:

–

siły elektrostatyczne przyciągające S do miejsca aktywnego,

–

uwięzienie substratów i produktów w ograniczonej objętości kompleksu
wieloenzymatycznego.

Reakcje wielosubstratowe.

Większość reakcji biologicznych zawiera 2 substraty i 2 produkty: A + B ↔ P + Q

W większości przypadków dochodzi w nich do przeniesienia grupy funkcyjnej (np.

fosforanowej czy amonowej) lub elektronów (reakcje redoks) między substratami.

Reakcje wielosubstratowe (dwusubstratowe) dzielimy na 2 klasy:

1. Reakcje przeniesienia sekwencyjnego:

W reakcji dwusubstratowej tworzy się trójskładnikowy przejściowy kompleks: E-S-S i E=P=P
W mechanizmie sekwencyjnym wszystkie SS muszą związać się z E przed uwolnieniem P.

Wyróżniamy:

- uporządkowany mechanizm sekwencyjny (substraty wiążą się z E w określonej sekwencji,
takie reakcje zwykle opisujemy diagramem Clelanda),

- przypadkowy mechanizm sekwencyjny (sekwencja łączenia substratów i uwalniania
produktów jest przypadkowa – np. reakcja kinazy keratynowej).

19

W diagramie Clelanda pojawiają się wielokąty z możliwymi wariantami.

2. Reakcje podwójnego przeniesienia (reakcje ping-pong).

Jeden lub więcej P jest uwalnianych przed związaniem wszystkich substratów. Istnieje
pośrednia forma enzymu z podstawioną grupą – forma, w której enzym jest czasowo

zmodyfikowany. Nie tworzy się trójskładnikowy przejściowy kompleks ESS, np. reakcja
aminotransferazy asparaginowej – reakcja przeniesienia grupy aminowej między

aminokwasem i ketokwasem: asparaginian + α-ketoglutaran ↔ glutaminian +
szczawiooctan.

Analiza kinetyki stanu stacjonarnego (steady-state) dla reakcji dwusubstratowej pozwala

rozróżnić reakcje przeniesienia sekwencyjnego oraz reakcje przeniesienia podwójnego.

Hamowanie aktywności enzymów.

Hamowanie aktywności enzymów przez małe cząsteczki lub jony jest głównym

mechanizmem kontroli.
Inhibitory są narzędziem badawczym w badaniu mechanizmu działania enzymów. Działanie

wielu leków i toksyn opiera się na inhibicji enzymów.

Wyróżniamy:

1. Inhibicję nieodwracalną (I (inhibitor) wiąże się kowalencyjnie lub bardzo silnie z E)

Np. penicylina kowalencyjnie modyfikuje bakteryjną transpeptydazę, co zapobiega

syntezie ścian komórkowych i prowadzi do śmierci bakterii,
Np. aspiryna kowalencyjnie modyfikuje cytooksygenazę co zmniejsza syntezę

cząsteczek sygnałowych stanu zapalnego.

20

2. Inhibicję odwracalną (szybka dysocjacja kompleksu EI)

– inhibicję kompetycyjną

– inhibicję niekompetycyjną

Rozróżnienie między inhibitorem kompetycyjnym, akompetycyjnym i niekompetycyjnym.

Inhibitor kompetycyjny wiąże się do miejsca aktywnego E, zapobiegając wiązaniu substratu z
enzymem.

Inhibitor akompetycyjny – wiąże się jedynie do kompleksu ES. Miejsce wiązania tego I jest
tworzone tylko podczas oddziaływania E i S. Inhibicji tej nie można przezwyciężyć podając

więcej S.
Inhibitor niekompetycyjny wiąże się do innego miejsca niż miejsce aktywne, nie zapobiega

wiązaniu substratu.

Inhibicja kompetycyjna.

I kompetencyjny zmniejsza szybkość katalizy przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu
wiążących substrat.

Przy danym [I], inhibicja może być zmniejszona przez zwiększenie [S].

Przykłady:

–

bursztynian (S) i malonian (I), enzym: dehydrogenaza bursztynianowi,

–

kofaktor tetrahydrofolian (koenzym) i jego analog strukturalny metotreksat (I) –

enzym: reduktaza dihydrofolianu. Metotreksat wiąże się 100x silniej do reduktazy niż
naturalny S (koenzym),

–

ibuprofen (lek) – inhibitor enzymów uczestniczących w szlakach sygnalizacji stanu
zapalnego,

–

statyny (leki obniżające wysoki poziom cholesterolu) – inhibitory kluczowego enzymu
biosyntezy cholesterolu).

Inhibicja niekompetycyjna.

I niekompetycyjny zmniejsza liczbę obrotów enzymu; nie wpływa na zmniejszenie liczby

cząsteczek E wiążących S. Inhibicji niekompetycyjnej nie można przezwyciężyć podając
większe stężenie S.

Inhibicja mieszana – I wpływa jednocześnie na wiązanie S i na liczbę obrotów E, wiążą się

poza miejscem wiązania S do E lub ES.

Kinetyczne rozróżnienie inhibicji kompetycyjnej i niekompetycyjnej.

Inhibicja kompetycyjna:

21

K

i

=

[

E ][ I ]
[

EI ]

– stała dysocjacji kompleksu EI (I – inhibitor kompetycyjny).

Im mniejsza K

i

, tym inhibicja jest skuteczniejsza.

Gdy stężenie I kompetycyjnego wzrasta, wyższe [S] są wymagane dla osiągnięcia danej
szybkości reakcji.

Przebieg reakcji sugeruje, w jaki sposób wystarczająco wysokie [S] może całkowicie
przezwyciężyć inhibicję kom petycyjną.

Pozorna wartość K

M

(pozorna stała Michaelisa) ulega zmianie i równa się ilościowo:

K

M

app

=

K

M

1[I ]

K

i

Im większe [I] tym większa K

M

app

.

Enzym ma taką samą V

max

+/- I kompetycyjny.

Efektem działania I kompetycyjnego jest zwiększenie K

M

app

,

a więc [S] potrzebnego do

uzyskania danej szybkości.

Wykres szybkości reakcji od ilości substratu (Michaelisa):

Wykres Lineweavera-Burka dla inhibicji kompetycyjnej: I kompetycyjny nie zmienia V

max

, ale

zwiększa K

M

.

Równanie LB:

1

V

0

=

1

V

max



K

M

V

max



1

[

S ]



22

Równanie LB przy inhibicji kompetycyjnej:

1

V

0

=

1

V

max



K

M

V

max



1

[

I ]

K

i



1

[

S ]



E+I ↔ EI

K

i

=

[

E ][ I ]
[

EI ]

W obecności I kompetycyjnego nachylenie wykresu rośnie o czynnik 1

[

I ]

K

i



, który mówi

nam o sile wiązania I.



1

[

I ]

K

i



= α

Przykład: Mamy E o K

M

= 10

-4

M czyli V

0

= V

max

/2 gdy S = 10-4 M.

W obecności 2 x 10

-3

M I kompetycyjnego, dla którego K

i

= 10

-3

M, wartość K

M

app

= K

M



1

[

I ]

K

i



= 3 x 10

4

M

Pamiętając, że V

0

=

V

max

[

S ]

[

S ]K

M

– równanie MM, gdy [S] = 10

-4

M, V

0

= V

max

/4, a więc

obecność I kompetycyjnego o połowę obniża szybkość reakcji przy takim stężeniu substratu.

Inhibicja akompetycyjna.

Inhibitor akompetycyjny – wiąże się jedynie do kompleksu ES. Miejsce wiązania tego I jest
tworzone tylko podczas oddziaływania E i S. Inhibicji tej nie można przezwyciężyć podając

więcej S.
I akompetycyjny obniża K

M

app

, która maleje wraz ze zwiększaniem [I] (enzym wiąże się do ES

zmniejszając [ES] stąd więcej S wiąże się do E aby utrzymać równowagę między E i ES).

23

V

max

nie może być osiągnięta.

Przykład: herbicyd glikofosforan – I akompetycyjny szlaku biosyntezy aminokwasów

aromatycznych.

Wykres Lineweavera-Burka dla inhibicji akompetycyjnej.

I akompetycyjny obniża K

M

app

p i V

max

app

o ten sam faktor 1

[

I ]

K

i



.

W obecności I akompetycyjnego nachylenie wykresu nie zmienia się, a punkt przecięcia osi Y

rośnie o faktor 1

[

I ]

K

i



.

Linie są równoległe.

Wykład 4 – 24.03.2009

24

Inhibicja niekompetycyjna.

Przebieg reakcji pokazuje, że S wiąże się zarówno do wolnego E jak i kompleksu EI. S może

wiązać się do EI ale kompleks EIS nie tworzy produktu. V

max

nie może być osiągnięta, nawet

przy wysokim [S].

I niekompetycyjny obniża stężenie funkcjonalnego enzymu, stąd:
V

max

jest obniżana do nowej wartości tzw. pozornej szybkości maksymalnej V

max

app

, podczas

gdy K

M

pozostaje niezmieniona.

V

max

app

=

V

max

1

[

I ]

K

i

Inhibicji tej nie można przezwyciężyć podając więcej S.

Wykres Lineweavera-Burka dla inhibicji niekompetycyjnej:

I niekompetycyjny nie zmienia K

M

, ale zmniejsza V

max

o czynnik 1

[

I ]

K

i



.

25

W obecności I niekompetycyjnego nachylenie wykresu V

max

app

/ K

M

rośnie o czynnik



1

[

I ]

K

i



. K

i

dla kompleksu EI oraz EIS są takie same.

α = 1 + 1

[

I ]

K

i



Przykład: deoksycyklina (antybiotyk) – inhibitor kolagenozy (enzym proteolityczny). Lek

stosuje się przy leczeniu chorób przyzębia.
Ołów – inhibitor wielu enzymów z grupami sulfhydrylowymi.

Inhibicja mieszana – I wpływa jednocześnie na wiązanie S i na liczbę obrotów E, wiążąc się

poza miejscem wiązania S do E lub ES.

Równanie i wykres LB:

1

V

0

=

K

M

V

max



1

[

S ]



α'

V

max

α=1

[

I ]

K

i

V

max

jest obniżana do nowej wartości – tzw. pozornej szybkości maksymalnej V

max

app

. K

M

rośnie do nowej wartości, pozornej K

M

. Aktywność enzymu zależy od pH. Zwykle optymalne

warunki pH odpowiadają warunkom, w których enzym funkcjonuje.

Wykorzystanie inhibitorów nieodwracalnych do identyfikacji (mapowania) grup miejsca

aktywnego enzymu.

Krystalografia rentgenowska pozwala na identyfikację grup funkcyjnych E po
zmodyfikowaniu ich przez inhibitor nieodwracalny.

Trzy kategorie inhibitorów nieodwracalnych:

26

1. Związki reagujące ze specyficznymi grupami

2. Analogi substratów
3. Inhibitory wywołujące „samobójstwo enzymu”.

Ad. 1. – np. DIPF i amid kwasu jodooctowego.

I nieodwracalny, diizopropylofluorofosforan (DIPF), hamuje enzymy (esterazę

acetylocholinową oraz chymotrypsynę) poprzez kowalencyjne modyfikowanie kluczowej
reszty seryny.

Amid kwasu jodooctowego hamuje nieodwracalne enzymy reagując z kluczową resztą
cysteiny.

Ad. 2. (affinity labels)

Są to cząsteczki strukturalnie podobne do S, które kowalencyjnie modyfikują reszty w

miejscu aktywnym E. Są bardziej specyficzne w stosunku do miejsca aktywnego od związków
reagujących ze specyficznymi grupami.

Keton chlorometylowy tosylo-L-fenyloalaniny (TPCK) jest aktywnym analogiem normalnego
substratu chymotrypsyny. TPCK wiąże się do miejsca aktywnego chymotrypsyny i modyfikuje

istotną resztę histydyny.

Ad. 3. (suicide inhibitors) czyli inhibitory wpływające na mechanizm reakcji (mechanism-
based inhibitors)

Najbardziej specyficzne narzędzie do modyfikacji miejsca aktywnego E.

I wiąże się do E (jak substrat), początkowo dochodzi do normalnej katalizy. Tworzy się
aktywny chemicznie intermediat, który hamuje E poprzez modyfikację kowalencyjną.

Zmodyfikowana grupa E jest katalitycznie aktywna, stąd E uczestniczy we własnej
nieodwracalnej inhibicji.

Inhibitory wpływające na mechanizm reakcji (inhibicja wywołująca samobójstwo enzymu):
Oksydaza monoaminowa (MAO), enzym ważny w syntezie neurotransmiterów, wymaga

obecności ko faktora FAD. Inhibitor, N,N-dimetylopropargiloamina hamuje MAO poprzez
kowalencyjne zmodyfikowanie FAD. Inhibitor jest najpierw utleniony, po czym na drodze

alkilacji N5 kowalencyjnie modyfikuje FAD. Addukt N-5 flawiny jest stabilizowany poprzez
dodanie protonu.

Inhibicja przez analogi stanu przejściowego pozwoliła zajrzeć w głąb katalizy.

Inhibitory potwierdzają, że istotą katalizy jest selektywne wiązanie stanu przejściowego, o

czym świadczy siła, z jaką te analogi stanu przejściowego działają jako inhibitory.

Przykład: 2-karboksypirol (I będący analogiem stanu przejściowego reakcji racemazy
prolinowej) wiąże się z tym E 160 razy silniej niż prolina – naturalny S – izomeryzacja L-

proliny do D-proliny prowadzona przez racemazę proliny, enzym bakteryjny, przechodzi

27

przez etap planarnego stanu przejściowego (występującego w jednej płaszczyźnie, w którym
węgiel α jest trygonalny, a nie tetragonalny).

Przeciwciała rozpoznające stan przejściowy działają jak katalizatory (abzymy). Pozwoliły

zrozumieć znaczenie stanu przejściowego.

Przykład: przeciwciało wyprodukowane używając inhibitora ferrochelatazy (n-
metyloprotoporfirynę), będącego strukturalnym analogiem stanu przejściowego

przeprowadzanej przez ten enzym reakcji, katalizowało reakcję tylko 10 x wolniej od E, a
2500 x szybciej w stosunku do reakcji nie katalizowanej.

Użycie analogu stanu przejściowego do wytworzenia przeciwciał katalitycznych.

Znaczenie analogów stanu przejściowego:

–

pozwalają na wgląd w mechanizm katalizy,

–

mogą służyć jako silne i specyficzne inhibitory enzymów,

–

mogą być użyte jako immunogenny do wytworzenia wielu nowych katalizatorów.

4 podstawowe sposoby regulacji enzymów:

1. Kontrola allosteryczna.

Aktywność enzymów allosteryczych ulega zmianie w odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe

(aktywatory czy inhibitory allosteryczne) lub informację przekazywaną między miejscami
aktywnymi.

2. Wielorakość form enzymów.

Izozymy lub izoenzymy umożliwiają zróżnicowaną regulację tej samej reakcji w różnym
miejscu i czasie. Izozymy to homologiczne enzymy w danym organizmie, które katalizują tę

samą reakcję ale różnią się nieznacznie strukturą i wartościami K

M

i V

max

oraz właściwościami

regulacyjnymi. Izoenzymy ulegają specyficznej ekspresji w różnych tkankach lub organellach

lub w różnych stadiach rozwojowych.

3. Odwracalna modyfikacja kowalencyjna

Zmiana aktywności enzymu przez odwracalne dodanie grupy modyfikującej, najczęściej

grupy fosforanowej.

4. Aktywacja proteolityczna

Nieodwracalne przekształcenie enzymu nieaktywnego w aktywny. Następuje hydroliza

jednego lub kilku wiązań peptydowych w nieaktywnym prekursorze enzymu – zymogenie czy
proenzymie (przykład: enzymy trawienne, kaspazy, enzymy procesu krzepnięcia krwi).

Kinetyka enzymów allosterycznych jest niezgodna z kinetyką Michaelisa-Menten.

Enzymy allosteryczne wykazują sigmoidalną zależność szybkości reakcji od stężenia
substratu.

28

Enzymy te składają się z kilku podjednostek i kilku miejsc aktywnych.
Związanie S do jednego miejsca aktywnego może zmienić właściwości innych miejsc

aktywnych w danej cząsteczce enzymu. Rezultatem jest kooperatywność wiązania substratu,
czyli wiązanie S do jednego miejsca aktywnego ułatwia wiązanie S do innych miejsc

aktywnych.
Aktywność tych enzymów może być zmieniana przez cząsteczki regulatorowe, które wiążą

się do specyficznych miejsc, innych niż miejsca katalityczne. Enzymy te są kluczowymi
regulatorami szlaków metabolicznych w komórce, gdyż ich właściwości katalityczne

zmieniają się w zależności od potrzeb komórki.

Karbamoilotransferaza asparaginowa (ATCaza) jest hamowana allosterycznie przez produkt
końcowy szlaku biosyntezy pirymidyn.

Reakcja ATCazy – w syntezie pirymidyn ATCaza katalizuje pierwszy etap, polegający na

kondensacji asparaginianu i karbamoilofosforanu do N-karbamoiloasparaginianu.

Hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego czyli przez produkt końcowy.

CTP hamuje ATCazę. Trifosforan cytydyny, końcowy produkt szlaku syntezy pirymidyn,
hamuje ATCazę pomimo niewielkiego podobieństwa strukturalnego do reaktantów lub

produktów reakcji katalizowanej przez ten enzym.
CTP wiąże się do miejsca allosterycznego (regulatorowego) i jest przykładem inhibitora

allosterycznego.

29

ATCaza składa się z odrębnych podjednostek katalitycznych i regulatorowych, które można
rozdzielić stosując związki rtęciowe reagujące z grupami tiolowymi.

p-hydroksyrtęciobenzoesan oddziałuje z kluczowymi resztami cysteiny w ATCazie,

powodując dysocjację ATCazy na dwa rodzaje podjednostek.

Badania ATCazy wykorzystujące metodę ultra irowania.

[wykresy]

Wzorce szybkości sedymentacji (A) natywnej ATCazy i (B) enzymu poddanego działaniu p-
hydroksyrtęciobenzoesanu wskazują, że enzym może ulec dysocjacji na dwa typy

podjednostek.

ATCaza: 2x(3x34kDa)+3x(2x17kDa).

Duże zmiany w strukturze IV-rzędowej pośredniczą w oddziaływaniach allosterycznych w
ATCazie.

Struktura IV-rzędowa ATCazy widziana z góry (rysunek). Widoczna jest pojedyncza cząsteczka

katalityczna tj. pojedynczy trimer (łańcuchy katalityczne (C) oznaczono kolorem niebieskim);
drugi trimer jest przyłączony za widocznym.

c- katalityczne

r- regulatorowe.

Lokalizacja miejsca aktywnego ATCazy → krystalizacja enzymu w obecności analogu pary
substratów (czyli analogu produktu pośredniego reakcji) – PALA – inhibitora

kompetycyjnego.
Miejsce aktywne ATCazy znajduje się w rejonie kontaktu między parami łańcuchów c w

obrębie trimeru c.
Miejsce aktywne składa się głównie z reszt należących do jednego łańcucha, ale łańcuch

sąsiedni także dostarcza ważne reszty.

30

Ponieważ miejsca aktywne znajdują się w miejscach kontaktu 2 łańcuchów c, każdy trimer c
dostarcza 3 miejsca aktywne. W sumie ATCaza ma 6 miejsc aktywnych.

N-fosfonoacetylo-L-asparaginian (PALA) jest analogiem produktu pośredniego reakcji i silnym
inhibitorem kompetycyjnym ATCazy.

Zmiany w strukturze IV-rzędowej w ATCazie (w miejscu aktywnym) wywołane związaniem
PALA – uwidocznienie dwóch stanów konformacyjnych (struktur IV-rzędowych). Dwa trimery

c rozsuwają się na odległość 1,2 nm i obracają się o ok. 10 stopni. Trzy dimery r obracają się
o 15 stopni.

Przejście z formy T do R w ATCazie. ATCaza istnieje w 2 stanach konformacyjnych:

- w zwartej stosunkowo nieaktywnej formie nazywanej formą T (ang. tense – napięta)
dominującej w nieobecności S ( o małym powinowactwie do S)

- rozszerzonej (rozsuniętej) formie nazywanej R (ang. relaxed – rozluźniona) dominującej w
obecności S ( o dużym powinowactwie do S).

Związanie PALA (inhibitora kompetycyjnego) stabilizuje formę R.

Forma T ma niższe powinowactwo względem S (SS) i stąd niższa aktywność katalityczna od
formy R.

W obecności jakiegoś stałego [S] lub [SS] enzym znajduje się w stanie równowagi między
formą T i R.

Osiągnięcie równowagi zależy od liczby miejsc aktywnych zajmowanych przez S.

CTP (jako inhibitor allosteryczny) wiąże się do podjednostek regulatorowych (6) ACTazy,

oddalonych od miejsc aktywnych (6).

Wiązanie CTP (inhibitora allosterycznego) z podjednostkami regulatorowymi ATCazy
stabilizuje formę T, przez co aktywność enzymu spada czyli zmniejsza się szybkość tworzenia

P (karbamoilofosforanu).

2c2+3r2 -> c6r6

Jednoprzejściowy mechanizm regulacji allosterycznej – cały E jest przekształcony z jednej
formy w drugą i wszystkie miejsca aktywne podlegają tym samym oddziaływaniom (zmiana

typu „wszystko albo nic”)

Forma R i forma T są w równowadze. Nawet przy braku S lub regulatora, ATCaza znajduje się
w stanie równowagi między formą T i R. Przy braku S, równowaga jest przesunięta w

kierunku form T, która występuje ok. 200x częściej.

Związanie I allosterycznego (CTP) przesuwa równowagę w kierunku formy T, co prowadzi do
zmniejszenia aktywności katalitycznej. Taki mechanizm regulacji allosterycznej nazywamy

mechanizmem jednoprzejściowym, tzn. cały enzym (wszystkie miejsca aktywne)
przekształcany jest w jedną formę (R lub T).

31

ATCaza wykazuje kinetykę sigmoidalną. Wykres zależności tworzenia produktu jako funkcji
[S] ma postać krzywej sigmoidalnej, ponieważ wiązanie substratu z jednym miejscem

aktywnym sprzyja przejściu całego enzymu w formę R, co zwiększa aktywność pozostałych 5
miejsc aktywnych, prowadząc do wzrostu całkowitej aktywności. Zatem miejsca aktywne

wykazują kooperatywność. Łańcuchy tworzące podjednostki współpracują ze sobą: gdy
jeden zmienia konformację, robią to wszystkie.

Krzywa sigmoidalna jest sumą dwóch krzywych M-M, z których jedna odpowiada formie T, a
druga formie R. Wzrost [S] faworyzuje przejście z krzywej formy T do krzywej formy R.

Otrzymanie krzywej sigmoidalnej w wyniku kooperatywności można zrozumieć wyobrażając

sobie enzym allosteryczny jako mieszaninę 2 enzymów typu M-M, z których jeden wykazuje
dużą wartość K

M

, co odpowiada formie T, a drugi – małą wartość K

M

, co odpowiada formie R.

W miarę wzrostu [S], równowaga przesuwa się z formy T w kierunku formy R, co prowadzi do
ostrego wzrostu aktywności, zależnego od [S].

Wyizolowany trimer c charakteryzuje się parametrami kinetycznymi formy R.

W przypadku ATCazy, w formie T, 3 trimery r utrzymują 3 trimery c wystarczająco blisko

siebie, aby kluczowe pętle na ich powierzchni zderzały się i przeszkadzały dostosowaniom
strukturalnym niezbędnym dla wiązania S z wysokim powinowactwem i dla katalizy.

Regulacje allosteryczne modulują stan równowagi między formami T i R.

Wpływ CTP na kinetyką ATCazy: CTP stabilizuje formę T ATCazy, sprawiając, że wiązanie S

jest utrudnione, co uniemożliwia przekształcenie enzymu w formę R. wskutek tego krzywa
ulega przesunięciu w prawo.

Wykład 5 – 07.04.2009

Zastosowanie abzymów:

1. Rozkładanie kokainy do nietoksycznych związków.

2. ADAPT – antibody-directed abzyme prodrug therapy.

32

3. Terapia raka – aldolaza.
4. Odporność na herbicydy.

5. Sepsa.
6. AIDS.

Uwagi końcowe: prof. Jeremy Lee, 1999:

1. Skuteczny abzym powinien przekształcać ok. 100 cząsteczek substratu na sekundę.

2. Otrzymanie skutecznego abzymu zajęło nam 10 lat.
3. Wprowadzenie skutecznego abzymu do użycia w medycynie zajmie 5-10 lat, ale

abzym umożliwiający usunięcie toksyn z ziaren roślin uprawnych zostanie
wprowadzony do użycia prawdopodobnie szybciej.

Kataliza w środowisku niewodnym.

Istnieją enzymy, których substraty są nierozpuszczalne w wodzie. W komórce znacząca

frakcja enzymów jest związana z błonami lub działa w lokalnych hydrofobowych
przedziałach.

Kataliza w środowisku niewodnym powinna być czymś naturalnym, szczególnie dla enzymów
innych niż hydrolazy.

Hydroliza jest także możliwa przy ograniczonej zawartości wody. Wraz z eliminacją wody
maleje szybkość reakcji.

To, co się dzieje z reakcjami hydrolizy przy malejącej zawartości wody ma duże znaczenie
praktyczne. Poprzez manipulowanie zawartością wody można kontrolować kierunek

przebiegu reakcji (oddziaływanie na stałą równowagi). Klasyczny przykład: lipazy.

Korzyści wynikające z katalizy w środowisku niewodnym:

–

zwiększona rozpuszczalność substratów niepolarnych,

–

zmiana specyficzności substratowej i stereospecyficzności (zależnie od użytego
rozpuszczalnika),

–

kontrola kierunku przebiegu reakcji czyli zmiana równowagi termodynamicznej.

Eliminacja wody umożliwia nie tylko odwrócenie reakcji, ale umożliwia także
biotransformacje, które w innych warunkach są niemożliwe.

O czym należy pamiętać manipulując zawartością wody?

Zmniejszanie zawartości wody w środowisku reakcji wymaga na nowo ustalenia danych
dotyczących stabilności enzymu i jego oddziaływania z substratem.

Możliwości wykorzystania katalizy w środowisku niewodnym:

–

Farmacja - preparaty immunologiczne (oligosacharydy, glikolizacja makrocząsteczek),

–

Detergenty (glikozydy wyższych alkoholi),

–

Chemia zapachów (glikozydy niektórych kwasów hydroksykarboksylowych),

–

Przemysł spożywczy (glikolipidy).

33

Możliwość kontrolowania kierunku reakcji katalizowanych przez enzymy oraz ich

specyficzności w środowisku niewodnym spowodowała rozwój tzw. inżynierii
rozpuszczalnikowej (nazywanej też szerzej „inżynierią środowiska reakcji”, z ang. medium

engineering), która dostarcza alternatywnych rozwiązań dla inżynierii białkowej.

Biokatalityczne plastiki – enzymy zmodyfikowane w kierunku zwiększenia rozpuszczalności
w rozpuszczalniku organicznym mogą być włączane w różnego rodzaju polimery, a uzyskane

w tej sposób struktury nazywane biokatalitycznymi plastikami, są aktywne i stabilne zarówno
w środowisku wodnym jak i rozpuszczalnika organicznego.

Jako enzym modelowy przy konstrukcji biokatalitycznych plastików stosuje się

chymotrypsynę. Jest aktywna w środowisku wodnym, jak i rozpuszczalnika organicznego. Jak
wiele proteaz obok wiązań peptydowych hydrolizuje również wiązania estrowe. Hydroliza

wiązań estrowych nie ma prawdopodobnie większego znaczenia fizjologicznego, służy jednak
jako reakcja modelowa (porównanie z enzymami syntetycznymi).

Enzymy syntetyczne – cząsteczka z hydrofobową kieszenią zawierającą odpowiednio

ułożone grupy funkcyjne, umożliwiające przekształcenie słabo wiązanego substratu, poprzez
silnie wiązany stan przejściowy, w produkt. Cząsteczka odpowiednio duża i podatna na

zmiany strukturalne.
Wykorzystanie: reakcje nie podlegające w naturze katalizie enzymatycznej. Konkurenci:

DNAzymy, ekstremozymy, kataliza w środowisku niewodnym.

Związki wykorzystywane do otrzymywania enzymów syntetycznych:

–

polimery syntetyczne (peptydy i poliaminokwasy, pochodne polietylenoiminy (bo

sama nie jest enzymem), polimery winylowe, polimydła),

–

związki makrocykliczne (paracyklofany, cyklodekstryny – przemysł farmaceutyczny i

spożywczy, do maskowania nieprzyjemnych smaków i zapachów, stabilizacji
substancji lotnych).

Triada katalityczna: 3 aminokwasy – asparaginian, histydyna, seryna.

Ustalenia końcowe: obecnie większy nacisk kładzie się na wybór substratu niż na konstrukcję

enzymu.

Ekstremozymy – narzędzia przetrwania organizmu w warunkach ekstremalnych.

Enzymy ekstremofili (ekstremozymy) zachowują aktywność w warunkach ekstremalnych:

Znaczenia:

–

zastosowania praktyczne,

–

korekta drzewa ewolucyjnego,

–

poznanie relacji struktura-właściwości.

34

Główne ośrodki badań: USA, Japonia, Niemcy.

Definicja warunków ekstremalnych:

–

pH - < pH 3 lub > pH 9,

–

temperatura - < 10⁰C lub > 45⁰C

–

zasolenie - > 15 % (w/v) NaCl,

–

rozpuszczalniki organiczne – np. > 1 % toluen,

–

jony metali ciężkich – np. > μM Hg lub Cd,

–

ciśnienie - > 50 MPa (50 atm)

–

UV - ?

–

X - ?

Poznane organizmy najbardziej ekstremotermofilne mogą żyć w 121⁰C.

Otrzymywanie ekstremozymów:

A. Od białka do genu

–

hodowla komórek z interesującego środowiska,

–

ekstrakcja białek,

–

poszukiwanie danej aktywności,

–

izolacja enzymu i genu,

–

klonowanie.

B. Od genu do białka

–

izolacja DNA organizmów z danego środowiska,

–

restrykcja DNA i transformacja bakterii,

–

selekcja transformantów w poszukiwaniu danej aktywności.

Modyfikacje ekstremozymów:

–

racjonalne planowanie: poznanie strukturalnych podstaw, właściwości i
wprowadzenie odpowiednich zmian w genie,

–

strategia Edisona: mutageneza i selekcja mutantów,

–

mieszanie szczepów: bakterii ewoluują raczej przez wymianę genów

(polichloropochodne difenylu).

Molekularne przystosowania enzymów z psychrofili:

–

enzymy te wykazują szczególnie wysoką wartość K

kat

/KM, czyli skuteczność

katalityczną, co kompensuje zwolnione tempo przebiegu reakcji chemicznych w
niskiej temperaturze (perfekcja katalityczna),

–

optymalizacja parametrów katalitycznych wynika prawdopodobnie z faktu, iż
struktura tych białek jest niesamowicie giętka i w trakcie katalizy dochodzi do

częstych zmian konformacyjnych.

Istnieje wiele sposobów praktycznego wykorzystania enzymów.

35

Detergenty:

Klasyfikacja detergentów zawierających enzymy:

–

proszki do prania,

–

płyny do mycia naczyń,

–

detergenty przemysłowe i instytucjonalne.

Krótka historia enzymatycznych proszków do prania:

1913: pierwszy enzymatyczny detergent (Burnus – wyciąg z trzustki)
1960-1970 – wprowadzenie proteazy bakteryjnej, zmiana formy enzymów (proszek w

granulat),
1980-1990 – wprowadzenie lipaz i celulaz, detergenty w postaci płynu,

~2000 – proszki „compact”

Enzymy stosowane obecnie w proszkach do prania:

1. Proteazy
–

proteazy serynowe z rodzaju Bacillus – usuwają plamy pochodzenia białkowego.

2. Amylazy
–

α-amylazy z rodzaju Bacillus – usuwają plamy pochodzenia skrobiowego.

3. Lipazy
–

Aspergillus oryzae (GMO) – Humicola lanuginosa lub wyciąg z trzustki – usuwają

plamy pochodzenia tłuszczowego.

4. Celulazy
–

neutralne (Humicola insolens) i alkaliczne (Bacillus sp.)

–

usuwają mikrofibryle, a razem z nimi brud,

–

powodują wzmocnienie koloru i zwiększenie miękkości tkaniny.

Badanie skuteczności działania enzymu w proszku do prania – parametry:

–

postać,

–

stosowana dawka proszku i jego skład,

–

pH roztworu proszku,

–

siła jonowa,

–

temperatura prania,

–

czas prania,

–

siły mechaniczne,

–

twardość wody,

–

poziom zabrudzenia,

–

rodzaj tkaniny.

Biosensory enzymatyczne.

Klasyczny przykład biosensora enzymatycznego: biosensor glukozowy (glukoza + O

2

→ kwas

glukonowy + H

2

O

2

).

36

Rozwiązania techniczne stosowane w biosensorach enzymatycznych:

–

enzym immobilizowany między błoną zewnętrzną i wewnętrzną, produkt reakcji
wykrywany przez elektrodę,

–

bufor zawierający enzym oraz substrat są wstrzykiwane do komory zawierająej
elektrodę,

–

enzym immobilizowany na powierzchni elektrody,

–

enzym jest bezpośrednio sprzężony z elektrodą.

Porównanie biosensorów enzymatycznych i mikrobiologicznych.

Biosensory mikrobiologiczne:

–

mniejsza podatność na hamowanie,

–

większa tolerancja na pH,

–

dłuższa możliwość działania,

–

tańsze (brak konieczności izolacji i oczyszczania enzymu),

–

dłuższy czas odpowiedzi na sygnał,

–

dłuższy czas powrotu do stanu wyjściowego,

–

konieczność zapewnienia selektywności reakcji.

Typy biosensorów mikrobiologicznych:

1. mierzące aktywność oddechową,

2. mierzące obecność elektrochemicznie aktywnych metabolitów,
3. wykorzystujące zjawisko luminescencji.

Przykłady substancji wykrywanych przez biosensory mikrobiologiczne:

–

DNA,

–

etanol,

–

glukoza,

–

aminokwasy – prolina, asparaginian, glutaminian, cysteina, fenyloalanina,

–

mocznik.

Istotną dziedziną zastosowania biosensorów jest detekcja organizmów patogennych, np.
system GeneXpert (firmy Cepheid) przyspiesza PCR i umożliwia detekcję bakterii wąglika.

Diagnostyka

Zastosowanie enzymów diagnostycznych:

1. Produkcja żywności – testy bezpieczeństwa,
2. Medycyna – analiza jakościowa i ilościowa, paski testowe,

Terapia

Możliwości terapeutycznego wykorzystania enzymów w terapii raka:

37

1. Zahamowanie ekspresji pewnych białek na poziomie mRNA – rybozymy i

deoksyrybozymy,

2. Enzymatyczna aktywacja czynnika terapeutycznego – enzymy białkowe.

Nanociała: nowe podejście w wykorzystaniu przeciwciał.

ADEPT a nanociała:

–

u dromaderów, ale także u dwugarbnych azjatyckich wielbłądów i
południowoamerykańskich lam około 50% Ab krążących we krwi nie ma łańcuchów

lekkich,

–

nanociała to przeciwciała pozbawione łańcuchów lekkich, skrócone do rejonów

zmiennych,

–

podstawowa charakterystyka nanociał: silne powinowactwo do antygenów, duża

sprawność molekularna, odporność na temperaturę i pH, mogą być kodowane przez
pojedynczy gen i produkowane przez mikroorganizmy (ok. 1 g z 1 l hodowli drożdży),

–

włączenie w ADEPT – przed fazą badań klinicznych

GDEPT: kontrolowana genetycznie enzymatyczna terapia nowotworów:

–

ekspresja enzymu i jego aktywność ograniczona tylko do komórek nowotworowych,

–

nie powinien istnieć jego endogenny analog,

–

zastosowany enzym nie może być toksyczny,

–

powinien wystąpić efekt widza (działanie na okoliczne komórki wskutek działania

enzymu w jednej komórce).

Lokalizacja enzymu ma podstawowe znaczenie dla aktywacji czynnika terapeutycznego.

Wiele leków działa jako inhibitory enzymów.

38