KINETYKA ENZYMÓW
Wyci g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
Kwas octowy – C
Triton X-100 – Xn, Rakotw. kat.3
Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten dla N-acetylo-β-D-glukozaminidazy ze linianek szczura
N-acetylo-β-D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wi zanie β-N-acetyloglukoz-aminylowe (na nieredukuj cym ko cu ła cucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywno ci acetylo-glukozaminidazy stosuje si substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylo-we.
CH2OH
CH
O
2OH
H
O
OH
2O
+
O
HO
NO
O
NO
2
2
OH
HO
OH
NHAc
NHAc
p-nitrofenol
p-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozamina
N-acetylo-β-D-glukozamina
Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długo ci fali λ = 405 nm.
Bufor do reakcji enzymatycznej:
st enie ko cowe ilo 58 mM kwas cytrynowy
1,520 g
41 mM NaH2PO4
0,707 g
100 ml, doprowadzi przy u yciu
0,1% Triton X-100
0,1 ml
NaOH do pH 4.2
Substrat:
p-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozamina
2 mg/ml buforu
Stoper:
0,4 M glicyna – NaOH pH 10.7
Wykonanie:
Przygotowa kolejne rozcie czenia wyj ciowego roztworu substratu o st eniu 2mg/ml – w tym celu pobra do oddzielnej probówki 200 µl wyj ciowego roztworu substratu i uzupełni buforem do obj to ci 400 µl. Cało wymiesza . Z tak przygotowanego rozcie czenia pobra obj to 200 µl i uzupełni buforem do obj to ci 400 µl. Otrzymany roztwór wymiesza .
Post powa analogicznie, a do otrzymania 5 kolejnych rozcie cze .
Do pi ciu oddzielnych probówek odpipetowa po: 600 µl buforu i 180 µl homogenatu.
Nast pnie do ka dej mieszaniny doda substratu o innym st eniu w ilo ci 180 µl.
Wymiesza . Mieszaniny inkubowa w temp. 37°C i po czasie 1, 2, 4, 6 i 8 min pobiera po
160 µl mieszaniny i przenosi do uprzednio przygotowanych probówek zawieraj cych 0.5 ml stopera. Absorbancj powstałego produktu zmierzy wobec lepych odczynnikowych (przygotowanych dla ka dego st enia substratu) przy długo ci fali λ = 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad. lepe odczynnikowe przygotowa nast puj co: do pi ciu kolejnych probówek odpipetowa po 130 µl buforu i 30 µl odpowiedniego st enia substratu, inkubowa w temp. 37°C przez 5 min, a nast pnie zatrzyma reakcje dodaj c po 0,5 ml stopera. Mno c warto absorbancji przez stał k = 1007 otrzymujemy st enie rozło onego substratu/powstałego produktu w nmol/ml. Masa 1 mola substratu = 342.3 g.
Opracowanie wyników:
Dla ka dego z u ytych st e substratu s wykre li krzywe kinetyczne wyra aj ce zale no przyrostu produktu c od czasu inkubacji t. Znale graficzne szybko ci pocz tkowe V0 i po sporz dzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczy graficznie warto ci Km i Vmax.
s = 0,125 (mg/ml) =
(mmol/l)
nr
A 405
c
t
v0
1/v0
1/s
Km
Vmax
próbki
(µM)
(min) (µM/min) (min/µM) (1/mM) (mM) (µM/min)
1
1
2
2
3
4
4
6
5
8
s = 0,250 (mg/ml) =
(mmol/l)
6
1
7
2
8
4
9
6
10
8
s = 0,500 (mg/ml) =
(mmol/l)
11
1
12
2
13
4
14
6
15
8
s = 1,000 (mg/ml) =
(mmol/l)
16
1
17
2
18
4
19
6
20
8
s = 2,000 (mg/ml) =
(mmol/l)
21
1
22
2
23
4
24
6
25
8
Oznaczanie aktywno ci trypsyny na substracie syntetycznym – wpływ pH i temperatury na aktywno enzymatyczn .
Trypsyna (EC 3.4.21.4; enzym proteolityczny soku trzustkowego, endopeptydaza z klasy hydrolaz) katalizuje m.in. reakcj hydrolizy wi za peptydowych, utworzonych przez grupy karboksylowe argininy (Arg) lub lizyny (Lys), w ła cuchu polipeptydów i białek.
Trypsyna katalizuje równie hydroliz wi zania estrowego czy amidowego w substratach syntetycznych b d cych pochodnymi Arg lub Lys. Je li substratem jest benzoilo-L-argininy p-nitroanilid (BAPNA) to po reakcji hydrolizy uwalnia si wolna p-nitroanilina, która wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długo ci fali λ = 405 nm.
NH2
C
NH +
2 Cl-
NH2
(CH2)3
C
NH +
2 Cl-
C
NH
CH COOH
trypsin
(CH2)3
H2O
C
NH
CH C
NH
NO2
+
BAPNA (bezbarwny)
H2N
NO2
p-nitroanilina (zólty)
Wykonanie:
1. Do jednej probówki odpipetowa 100 µl roztworu trypsyny roboczej a do drugiej 100 µl 1 mM HCl. Do obu probówek doda po 1 ml 0,2 M buforu Tris-HCl o pH 8,0 i po 20 µl roztworu substratu BAPNA. Wymiesza i inkubowa 15 min w temp. 37°C.
Reakcj zatrzyma dodaj c 100 µl st onego kwasu octowego i zmierzy , wzgl dem wody destylowanej, absorbancj powstałej p-nitroaniliny przy długo ci fali λ = 405
nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Oceni przydatno metody.
2. Do siedmiu probówek odpipetowa po 100 µl roboczego roztworu trypsyny, a do ósmej 100 µl 1 mM HCl. Do siedmiu pierwszych probówek doda po 1 ml buforów o pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, a do ostatniej probówki doda 1 ml buforu o pH 7. Nast pnie do ka dej probówki doda po 20 µl substratu BAPNA i inkubow w temp. 37°C przez 15
min. Reakcje zatrzyma dodaj c po 100 µl st onego kwasu octowego i dokona pomiaru absorbancji wzgl dem próby lepej (ósma probówka) przy długo ci fali λ =
405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad.
Opracowanie wyników:
Wykre li wykres zale no ci aktywno ci wła ciwej od pH roztworu i wyznaczy optimum działania trypsyny dla BAPNA jako substratu, przyjmuj c jako jednostk aktywno ci przyrost absorbancji o 0,1 w warunkach do wiadczenia. Aktywno wła ciwa to ilo jednostek aktywno ci przypadaj ca na 1 mg enzymu.
pH A (405 nm) Aktywo enzymatyczna Aktywno wła ciwa U (µmol/min)
U/mg
4
5
6
7
8
9
10
3. Do pi ciu probówek odpipetowa po 50 µl roboczego roztworu trypsyny a do szóstej probówki 50 µl 1 mM HCl. Nast pnie do wszystkich probówek doda po 1 ml 0,2 M
buforu Tris-HCl o pH 8,0 i po 20 µl roztworu substratu BAPNA. Wymiesza i inkubowa 30 min w temp. 0, 25, 37, 48 i 60°C. Reakcj zatrzyma dodaj c po 100 µl st onego kwasu octowego i zmierzy absorbancj wzgl dem próby lepej (szósta probówka) przy długo ci fali λ = 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad.
Opracowanie wyników:
Wykre li wykres zale no ci aktywno ci wła ciwej trypsyny od temperatury inkubacji.
Przedyskutowa wyniki.
Temp. A (405 nm) Aktywo enzymatyczna Aktywno wła ciwa
(°C)
U (µmol/min)
U/mg
0
25
37
48
60
Odczynniki:
0,01 mM trypsyna (2,4 mg trypsyny w 10 ml 1 mM HCl) – przechowywana w lodzie.
Roztwór trypsyny roboczej – rozcie czy trypsyn 10 razy przy pomocy 1 mM HCl tzn.
odpipetowa 100 µl wyj ciowego roztworu trypsyny i doda 900 µl 1 mM HCl. Roztwór roboczy enzymu przechowywa w lodzie. Substrat – 25 mM benzoilo-L-argininy p-nitroanilid (BAPNA) w dimetylosulfotlenku (DMSO) (11 mg/ml). St ony kwas octowy do przerywania reakcji enzymatycznej. Bufory: 0,2 M Tris-HCl o pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10.
Materiały i sprz t laboratoryjny:
pipety automatyczne, termostatowana ła nia wodna, spekrofotometr, probówki, lód Literatura:
1) B.D. Hames, N.M.Hooper: „Krótkie wykłady. Biochemia” (red. J. Michajda, A.
Augustyniak, K. Ziemnicki), Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2004, str. 95-104.
2) „Techniki bada fizjologicznych” (red. A. Lity ska, M.H. Lewandowski), str. 78-79.