SPRAWOZDANIE Z BIOCHEMII

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Teoria:

Kinetyka enzymatyczna - dział chemii fizycznej zajmujący się badaniem czasowego przebiegu reakcji chemicznych katalizowanych przez enzymy. Jest to szczegółowy dział kinetyki chemicznej. Także, w bardziej ogólnym ujęciu, kinetyka enzymatyczna to charakterystyka reakcji enzymatycznych ze szczególnym uwzględnieniem ich szybkości, przebiegu i mechanizmów. Badanie kinetyki reakcji z udziałem enzymów pozwala na poznanie sposobu fizjologicznej kontroli enzymów w komórkach, ich roli w metabolizmie czy wpływu inhibitorów i aktywatorów na ich aktywność.

Enzymy to białkowe katalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne wskutek obniżenia energii aktywacji potrzebnej do przebiegu tych reakcji. Enzymy wiążą substraty w swoim centrum aktywnym i przetwarzają na produkty w sekwencji kroków definiowanych przez mechanizmy katalizy enzymatycznej. Mechanizmy te można podzielić na mechanizmy katalizy pojedynczego substratu i katalizy wielu substratów.

Tak jak wszystkie katalizatory enzymy używają tych samych substratów, czego wynikiem są takie same produkty, jak miało by miejsce w reakcji niekatalizowanej. Enzymy nie zmieniają także stanu równowagi reakcji chemicznej, a jedynie przyspieszają jego ustalenie. Zazwyczaj w obecności enzymu reakcja zachodzi w kierunku takim samym, w jakim by zachodziła spontanicznie, jedynie wzrasta jej szybkość. Enzymy jednak potrafią się wysycić substratami. Oznacza to, że przy stałej ilości enzymu, a rosnącej substratów, prędkość reakcji będzie rosnąć, ponieważ wysycane są kolejne, jeszcze nie zajęte, miejsca aktywne enzymów. Jednak po maksymalnym wysyceniu enzymów substratami, co w praktyce oznacza, że każde miejsce aktywne ma związany substrat lub produkt pośredni reakcji, reakcja osiąga maksymalną prędkość i dalsze dodawanie substratów tego nie zmienia. Dwie najważniejsze cechy enzymu określają jak szybko wysyca się on swoimi substratami (maksymalne stężenie substratu przy stałej ilości enzymu) oraz jak zwiększają szybkość reakcji chemicznej.

Inhibitor – związek chemiczny powodujący zahamowanie bądź spowolnienie reakcji chemicznej. Proces ten nazywa się inhibicją. Inhibitorem można nazwać zarówno substancję powodującą spowolnienie lub zatrzymanie reakcji niekatalizowanej jak i substancję obniżającą aktywność katalizatora w reakcji katalizowanej. 

Ze względu na mechanizm działania na enzym dzieli się je na:

• inhibitory kompetycyjne 

• inhibitory akompetycyjne

• inhibitory niekompetycyjne

Aktywator enzymatyczny – substancja chemiczna umożliwiająca lub poprawiająca działanie enzymów. Ich działanie polega na odszczepianiu od nieaktywnych proenzymów blokujących grup funkcyjnych (rodników) lub ochronie enzymów przed działaniem różnych czynników chemicznych.

Stała Michaelisa (K_m) – takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej (V_max) tej reakcji. Stała ta jest wyrażana w molach na dm³ i określa powinowactwo enzymu do substratu: im jest mniejsza, tym powinowactwo jest większe, natomiast duża wartość tej stałej mówi o małym powinowactwie enzymu do substratu.

Wartość stałej K_m dla większości enzymów przyjmuje wartości z zakresu 10^-5 do 10^-3 mol/dm³.

Równanie Michaelisa-Menten pochodzące od nazwisk Leonora Michaelisa i Maud Menten opisuje zależność szybkości reakcji od stężenia substratu: 

1. Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej

Do czterech probówek nalewamy po 5cm³ 1% roztworu skrobi w 0,3% NaCl. Probówkę nr 1 wstawiamy do naczynia z lodem. Następnie do probówki nr 1 dodajemy 3cm³ schłodzonej amylazy, do probówki nr 2 i 3 także dodajemy po 3cm³ roztworu α-amylazy śliny w temperaturze pokojowej, a do probówki nr 4 uprzednio zagotowanego roztworu śliny. Zawartość poszczególnych probówek mieszamy.

Probówkę nr 1 umieszczamy w naczyniu z lodem, probówkę 2 pozostawiamy w temperaturze pokojowej, a probówkę nr 3 i 4 umieszczamy w łaźni wodnej w temperaturze 38-40^oC.

Po upływie 10 minut wyjmujemy probówki z łaźni wodnej i ochładzamy. W probówkach 2,3 i 4 wykonujemy próbę jodową na obecność skrobi. Z probówki nr 1 odlewamy 4cm³ roztworu i także wykonujemy próbę jodową.

Probówkę 1 z pozostałą zawartością umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 38-40^oC na 10 minut, ochładzamy i wykonujemy próbę z I₂ w KI.

Zaobserwowaliśmy następujące zabarwienia po przeprowadzeniu próby jodowej:

- w probówce 1 – barwa ciemno-pomarańczowa

- w probówce 2 – barwa pomarańczowa

- w probówce 3 – barwa pomarańczowa

- w probówce 4 – barwa granatowa

Wnioski:

Próba jodowa jest sposobem na określenie zawartości skrobi w badanej cieczy. Barwa granatowa w probówce 4 świadczy o obecności skrobi w roztworze, co oznacza, że α-amylaza poddana wysokiej temperaturze (100^oC) traci swoją aktywność i nie rozkłada skrobi. W pozostałych probówkach skrobia została rozłożona. Na podstawie wyników tego doświadczenia można stwierdzić, że optymalny zakres temperatury działania α-amylazy wynosi 38 - 40 °C, a enzym działa mniej efektywnie w niższej temperaturze.

1. Wpływ pH środowiska na szybkość reakcji enzymatycznych

Przygotowujemy bufory fosforanowe o różnym pH mieszając odpowiednie ilości roztworów Na₂HPO₄ i KH₂PO₄ o stężeniu o,15 mol/dm³:

Lp	pH	Na2HPO4 x 2H2O (cm^3)	KH2PO4 (cm^3)
1 2 3 4 5 6 7 8	5,3 5,8 6,3 6,8 7,3 7,8 8,3 8,8	0,27 0,83 2,31 5,00 7,64 9,11 9,73 9,99	9,73 9,17 7,69 5,00 2,36 0,89 0,27 0,07

Do ośmiu probówek nalewamy po:

- 2,5 cm³ buforowego roztworu o różnych wartościach pH w zakresie 5,3 – 8,8,

- 2,5 cm³ 1% roztworu skrobi,

- 2,5 cm³ wyciągu α-amylazy śliny.

Zawartość probówek mieszamy i pozostawiamy w temperaturze pokojowej. Co 2-3 minuty z probówki 4 (pH = 6,8) pobieramy po kilka kropel mieszaniny i przeprowadzamy próbę z jodem. Gdy próba wykazała czerwono-brunatne zabarwienie, wówczas po 2 minutach do wszystkich ośmiu probówek dodajemy 2-3 krople roztworu I₂ w KI. Uzyskujemy następującą gamę kolorów: od ciemnej brunatno-czerwonej w probówce 1, która stopniowo zmieniała się do ciemnej granatowej w probówce 8.

Wnioski:

Optimum pH dla większości enzymów występuje przy wartościach bliskich odczynu obojętnego. Wpływ pH na aktywność enzymów wiąże się z faktem, że enzymy jako białka posiadają wiele aminokwasów ulegających jonizacji, a aminokwasy centrum aktywnego często mogą pełnić swoją rolę tylko w określonym stanie jonizacji. Optymalnym pH dla amylazy jest przedział 5,3-7,3, ponieważ w probówkach o takim pH nie zaobserwowano granatowej barwy świadczącej o nierozłożeniu skrobi.

1. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na aktywność enzymów

Do trzech probówek zawierających po 2cm³ 1% kleiku skrobiowego nalewamy po 1cm³ następujących roztworów:

- do probówki 1 – H₂O destylowanej

- do probówki 2 – 1% NaCl

- do probówki 3 – 1% CuSO₄.

Następnie do wszystkich probówek nalewamy po 1cm³ roztworu amylaz śliny, mieszamy i inkubujemy w temperaturze 38^oC.

Po upływie 10 minut probówki przenosimy do naczynia z lodem i po ochłodzeniu wykonujemy próbę jodową.

Otrzymujemy następujące zabarwienia:

- w probówce 1 barwę ciemno-granatową

- w probówce 2 barwę brunatno-czerwoną

- w probówce 3 barwę pomarańczową.

Wnioski:

Aktywatory to substancje chemiczne zwiększające aktywność enzymu. Inhibitory to związki powodujące spowolnienie lub zatrzymanie reakcji chemicznej. Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia możemy stwierdzić, że dla amylazy ślinowej aktywatorem jest CuSO₄. Inhibitorem jest woda destylowana. NaCl powoduje wolniejsze zachodzenie reakcji.

1. Wpływ stężenia substratu na aktywność enzymu

Doświadczenie to nie zostało przeprowadzone z powodu niewystarczającej ilości czasu na zajęciach laboratoryjnych.

1. Wpływ stężenia enzymu na jego aktywność

Doświadczenie to nie zostało przeprowadzone z powodu niewystarczającej ilości czasu na zajęciach laboratoryjnych.