BIOCHEMIA

ENZYMY

Kinetyka

 

 

Czynniki wpływające na szybkość 
reakcji enzymatycznej 



Stężenie substratu



Aktywatory, inhibitory



pH



Temperatura

 

 

Stężenia substratu



Zależność polega na tym, że przy małych stężeniach 
podwojenie [S] powoduje podwojenie początkowej szybkości 
(Vo)



Przy większych stężeniach substratu, enzym ulega 
wysyceniu i dalszy wzrost [S] powoduje tylko małą zmianę 
Vo. Przy wysycających stężeniach substratu praktycznie 
wszystkie cząsteczki enzymu zawierają związany substrat.



Kształt wykresu Vo jako funkcja [S] jest hiperbolą.

 

 

Wpływ temperatury:



Wzrost temperatury zwiększa energię termiczną

 

cząsteczek substratu co powoduje zwiększenie 

proporcji cząsteczek substratu mających dostateczną 

ilość energii, aby przekroczyć energię aktywacji



Jednak 

wzrastająca energia termiczna cząsteczek 

zwiększa szansę zerwania licznych słabych wiązań 

niekowalencyjnych

 (wiązania wodorowe, siły van der 

Waalsa) utrzymujących trójwymiarową strukturę 

enzymu. co może prowadzić do denaturacji 

(rozfałdowania) enzymu, nawet małe zmiany 

trójwymiarowego kształtu enzymu mogą zmienić 

strukturę miejsca aktywnego i doprowadzić do 

spadku aktywności katalitycznej.

 

 

Wykres zależności Vo od temperatury ma kształt krzywej o wyraźnie
zaznaczonym optimum termicznym. 
Dla wielu enzymów ssaków przypada ono na około 37°C, ale istnieją
organizmy, których enzymy zaadaptowały się do działania w temperaturach
zarówno wyższych, jak i niższych. Np. Polimeraza Taq, której używa się 
w łańcuchowej reakcji polimeryzacji występuje u bakterii żyjącej w gorących 
źródłach.

 

 

Różne enzymy wykazują różne 
optima pH.
Małe odchylenia pH od wartości 
optymalnej powodują spadek 
aktywności wywołany zmianami  
jonizacji  grup w aktywnym 
miejscu enzymu. Większe 
odchylenia pH prowadzą do 
denaturacji enzymu. 
Wykres Vo jako funkcja pH ma 
zazwyczaj kształt dzwonu. 
Optimum pH dla większości 
enzymów wynosi w pobliżu 6,8. 

 

 

Równanie Michaelisa-Menten



(V

max

- v

0

)(K

m

+[S])=V

max 

x 

K

m

 

 

Określenie szybkości początkowej. Ilość produktu tworzonego przy różnych
 stężeniach substratu jest wykreślona jako funkcja czasu. Szybkość początkowa
 (Vo) dla każdego stężenia substratu jest wyznaczona z nachylenia krzywej na
 początku reakcji, gdy reakcja odwrotna jest jeszcze nieznaczna. 

 

 

Stężenie substratu, przy którym prędkość reakcji osiąga połowę prędkości 
maksymalnej  nosi nazwę stałej Michaelisa (K

m

). Jest ona miarą powinowactwa

enzymu do określonego substratu. Wyraża się ją w molach substratu na litr roztworu.

 

 

Stała Michaelisa-Menten opisuje odwrotnie 
proporcjonalnie
powinowactwo enzymu do substratu –przykładowe 
wartości stałej Michaelisa

 

 

Wykres Lineweavera-Burka przedstawia 1/Vo jako funcję 1/[s]. 

 

 

Zależność prędkości reakcji od stężenia substratu można przedstawić w postaci 
wykresu Lineweavera-Burka. Zależność ma charakter liniowy.

 

 

Inhibicja enzymów



Nieodwracalna



Odwracalna:

- kompetycyjna
- niekompetycyjna

 

 

Inhibitory enzymów

Metotreksat – jest strukturalnym analogiem  tetrahydrofolianu, koenzymu reduktazy
dihydrofolianu biorącej udział  w biosyntezie puryn i pirymidyn. Metotreksat wiąże się
do  reduktazy dihydrofolianu 1000-krotnie silniej niż naturalny substrat i hamuje
syntezę zasad azotowych. Związek ten jest używany w leczeniu raka. 

 

 

Kinetyka reakcji enzymatycznej
z inhibitorem kompetycyjnym. 
Ponieważ stężenie inhibitora wzrasta
wymagane są większe stężenia 
substratu do osiągnięcia danej szybkości
reakcji. 
Przebieg reakcji sugeruje, w jaki sposób
wystarczająco duże stężenie substratu
może całkowicie  przezwyciężyć
inhibicję kompetycyjną.

 

 

 

 

 

 

Model Michaelisa-Menten – kompleks ES koniecznym etapem pośrednim
procesu katabolicznego. E łączy się z S tworząc ES ze stałą szybkością k1.
Istnieją dwie możliwości rozpadu kompleksu ES. Może dysocjować do E i S
ze stałą szybkości k-1 lub przekształcać się tworząc produkt ze stałą szybkości k2.
Zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu
w wyjściowy S.

 

 

Kinetyka reakcji enzymatycznej
z inhibitorem niekompetycyjnym.
Przebieg reakcji pokazuje, że
inhibitor wiąże się zarówno do
wolnego enzymu, jak i kompleksu
enzym-substrat. W rezultacie, V

max

nie może być osiagnięta, nawet 
przy dużym stężeniu substratu.

 

 

 

 

 

 

CTP wzmacnia początkową fazę krzywej sigmoidalnej i hamuje aktywność
karbamoilotransferazy asparaginianowej (ATCazy). W obecności CTP enzym staje się
mniej podatny na efekty kooperatywne, ułatwiane przez związanie substratu; 
Niezbędna jest większa ilość substratu do osiągnięcia danej szybkości reakcji. 
ATP jest także regulatorem allosterycznym ATCazy. Jego wpływ polega
na wzroście szybkości reakcji w danym stężeniu asparaginianu. 
W dużym stężeniu ATP  kinetyczny profil wykazuje mniej wyraźne zachowanie
sigmoidalne.

 

 

Enzymy allosteryczne działają niezgodnie z 
kinetyką Michaelisa-Menten



Enzymy allosteryczne składają się z kilku podjednostek i 
kilku miejsc aktywnych.



Wykres zależności szybkości  reakcji Vo od stężenia 
substratu [S] często przybiera kształt sigmoidalny w 
odróżnieniu od kszałtu hiperboli – dla równania Michaelisa-
Menten.



W enzymach allosterycznych, związanie  substratu do 
jednego miejsca aktywnego może zmienić właściwości 
innych miejsc aktywnych w tej samej cząsteczce enzymu. 
Rezultatem takiego oddziaływania między podjednostkami 
może być kooperatywność wiązania substratu, czyli 
wiązanie substratu do jednego miejsca aktywnego enzymu 
ułatwia wiązanie substratu  do innych miejsc aktywnych.

 

 

Jednostki enzymatyczne



Wg IUB 

Jednostką (U) każdego enzymu jest 

taka jego ilość, która katalizuje przemianę 1mola 

substratu (lub 1mola  odpowiednich grup 

chemicznych) w ciągu 1 min w temp. 30

o

C  i w 

optymalnych warunkach (stęż. substratu, pH).



 Aktywność molekularna ilość cząsteczek 

substratu przekształcanych w ciągu 1 min przez 1 
cząsteczkę enzymu

 

 

Jednostki enzymatyczne

Katal jest przyjętą w układzie SI jednostką aktywności 
enzymu, 
zdefiniowaną jako aktywność katalityczna, która 
zwiększa szybkość reakcji w specyficznym układzie o 
jeden mol na sekundę.

Jednostką enzymatyczną (U) jest ilość enzymu, która 
katalizuje 
przekształcenie1 µmola substratu w ciągu jednej 
minuty w temp. 25°C, w warunkach optymalnych dla 
danego enzymu.

Katal jest zbyt duży dla większości zastosowań i jest 
zazwyczaj wyrażany w mikrokatalach, nanokatalach i 
pikokatalach.

1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x10

6

 μmol/min = 6x10

7 

U

1U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat  = 16.67x10

-9

 kat 

 

 

Test optyczny  Warburga do pomiaru 
aktywności enzymów



NADH absorbcja  260 i 

340

 nm



NAD absorbcja  260 nm

NADH i NADPH są używane do pomiaru absorbancji w celu oznaczania enzymów:
Gdy w przebiegu reakcji powstaje NADH i NADPH
następuje wzrost absorbancji przy 340nm
Gdy w przebiegu reakcji powstaje NAD i NADP
następuje spadek ponieważ nie  absorbują promieniowania przy 340nm

 

 

 

 

Zastosowanie enzymów w praktyce 
medycznej:



Enzymy jako markery chorób

-

aminotransferazy (zawał mięsnia sercowego, uszkodzenie 

wątroby),

-

amylaza (zapalenie trzustki)

-

LDH (zawał mieśnia sercowego)



Enzymy jako leki i odczynniki

-

Tkankowy aktywator plazminogenu i urokinaza (leczenie choroby 

zakrzepowej)

-

Lipaza ( w leczeniu zaburzeń wydzielniczych trzustki

-

Ureaza ( odczynnik do oznaczania mocznika)

-

Kolagenaza (do oznaczania kolagenu w ilościach niewykrywalnych 

innymi metodami, np. w hodowlach komórek in vitro. 



Enzymy w biotechnologii i terapii genowej 

-

  Za pomocą nukleaz można wycina pewne fragmenty kwasów 

nukleinowych i wszczepiać je do chorych komórek tego samego 

gatunku co pozwala na wyeliminowanie wadliwie zbudowanych 

odcinków DNA

 

 

Test optyczny Warburga

 

 

 



zasada: NADH, koenzym enzymów przenoszących 

wodór, silnie pochłania światło o dług. fali 300-370 

nm, natomiast jego postać utleniona - NAD nie 

wykazuje w tym zakresie fali żadnej absorpcji. Na 

podstawie pomiarów absorbancji w odpowiednim 

paśmie (334,340 lub 366 nm) można oznaczyć 

bezpośrednio przebieg utleniania lub redukcji w tej 

reakcji; taka sama reguła stosuje się do NADPH;



podstawa kinetycznego pomiaru przebiegu reakcji 

katalizowanych przez enzymy przenoszące proton 

(tzw. test optyczny prosty) oraz w połączeniu z 

reakcjami wskaźnikowymi i pomocniczymi – przez 

inne enzymy, np. transferazy, kinazy i niekiedy 

hydrolazy;



czas reakcji (inkubacji) – kilka minut, przebieg 

kontrolowany w postaci odczytu absorbancji co 1 

minutę. 

 

 



Są to molekularne formy danego enzymu 

powstające w wyniku ekspresji różnych genów;



Katalizują tę samą reakcję biochemiczną, ale 

różnią się strukturą pierwszorzędową, 

właściwościami fizycznymi, parametrami 

kinetycznymi, kofaktorami, ruchliwością 

elektroforetyczną, a także immunologicznie [mają 

inny punkt izoelektryczny, optimum pH, 

powinowactwo do substratu, inną wrażliwość na 

inhibitory]. Dzięki tym różnicom izoenzymy są 

lepiej przystosowane do swoistych warunków 

tkankowych i przemian metabolicznych narządu 

czy tkanki;



Różne formy izoenzymów danego enzymu 

pochodzą zazwyczaj z różnych genów i często 

występują w różnych tkankach ciała;