BIOCHEMIA

ENZYMY

Kinetyka

Czynniki wpływające na szybkość
reakcji enzymatycznej



Stężenie substratu



Aktywatory, inhibitory



pH



Temperatura

Stężenia substratu



Zależność polega na tym, że przy małych stężeniach
podwojenie [S] powoduje podwojenie początkowej szybkości
(Vo)



Przy większych stężeniach substratu, enzym ulega
wysyceniu i dalszy wzrost [S] powoduje tylko małą zmianę
Vo. Przy wysycających stężeniach substratu praktycznie
wszystkie cząsteczki enzymu zawierają związany substrat.



Kształt wykresu Vo jako funkcja [S] jest hiperbolą.

Wpływ temperatury:



Wzrost temperatury zwiększa energię termiczną

cząsteczek substratu co powoduje zwiększenie

proporcji cząsteczek substratu mających dostateczną

ilość energii, aby przekroczyć energię aktywacji



Jednak

wzrastająca energia termiczna cząsteczek

zwiększa szansę zerwania licznych słabych wiązań

niekowalencyjnych

(wiązania wodorowe, siły van der

Waalsa) utrzymujących trójwymiarową strukturę

enzymu. co może prowadzić do denaturacji

(rozfałdowania) enzymu, nawet małe zmiany

trójwymiarowego kształtu enzymu mogą zmienić

strukturę miejsca aktywnego i doprowadzić do

spadku aktywności katalitycznej.

Wykres zależności Vo od temperatury ma kształt krzywej o wyraźnie
zaznaczonym optimum termicznym.
Dla wielu enzymów ssaków przypada ono na około 37°C, ale istnieją
organizmy, których enzymy zaadaptowały się do działania w temperaturach
zarówno wyższych, jak i niższych. Np. Polimeraza Taq, której używa się
w łańcuchowej reakcji polimeryzacji występuje u bakterii żyjącej w gorących
źródłach.

Różne enzymy wykazują różne
optima pH.
Małe odchylenia pH od wartości
optymalnej powodują spadek
aktywności wywołany zmianami
jonizacji grup w aktywnym
miejscu enzymu. Większe
odchylenia pH prowadzą do
denaturacji enzymu.
Wykres Vo jako funkcja pH ma
zazwyczaj kształt dzwonu.
Optimum pH dla większości
enzymów wynosi w pobliżu 6,8.

Równanie Michaelisa-Menten



(V

max

- v

0

)(K

m

+[S])=V

max

x

K

m

Określenie szybkości początkowej. Ilość produktu tworzonego przy różnych
stężeniach substratu jest wykreślona jako funkcja czasu. Szybkość początkowa
(Vo) dla każdego stężenia substratu jest wyznaczona z nachylenia krzywej na
początku reakcji, gdy reakcja odwrotna jest jeszcze nieznaczna.

Stężenie substratu, przy którym prędkość reakcji osiąga połowę prędkości
maksymalnej nosi nazwę stałej Michaelisa (K

m

). Jest ona miarą powinowactwa

enzymu do określonego substratu. Wyraża się ją w molach substratu na litr roztworu.

Stała Michaelisa-Menten opisuje odwrotnie
proporcjonalnie
powinowactwo enzymu do substratu –przykładowe
wartości stałej Michaelisa

Wykres Lineweavera-Burka przedstawia 1/Vo jako funcję 1/[s].

Zależność prędkości reakcji od stężenia substratu można przedstawić w postaci
wykresu Lineweavera-Burka. Zależność ma charakter liniowy.

Inhibicja enzymów



Nieodwracalna



Odwracalna:

- kompetycyjna
- niekompetycyjna

Inhibitory enzymów

Metotreksat – jest strukturalnym analogiem tetrahydrofolianu, koenzymu reduktazy
dihydrofolianu biorącej udział w biosyntezie puryn i pirymidyn. Metotreksat wiąże się
do reduktazy dihydrofolianu 1000-krotnie silniej niż naturalny substrat i hamuje
syntezę zasad azotowych. Związek ten jest używany w leczeniu raka.

Kinetyka reakcji enzymatycznej
z inhibitorem kompetycyjnym.
Ponieważ stężenie inhibitora wzrasta
wymagane są większe stężenia
substratu do osiągnięcia danej szybkości
reakcji.
Przebieg reakcji sugeruje, w jaki sposób
wystarczająco duże stężenie substratu
może całkowicie przezwyciężyć
inhibicję kompetycyjną.

Model Michaelisa-Menten – kompleks ES koniecznym etapem pośrednim
procesu katabolicznego. E łączy się z S tworząc ES ze stałą szybkością k1.
Istnieją dwie możliwości rozpadu kompleksu ES. Może dysocjować do E i S
ze stałą szybkości k-1 lub przekształcać się tworząc produkt ze stałą szybkości k2.
Zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu
w wyjściowy S.

Kinetyka reakcji enzymatycznej
z inhibitorem niekompetycyjnym.
Przebieg reakcji pokazuje, że
inhibitor wiąże się zarówno do
wolnego enzymu, jak i kompleksu
enzym-substrat. W rezultacie, V

max

nie może być osiagnięta, nawet
przy dużym stężeniu substratu.

CTP wzmacnia początkową fazę krzywej sigmoidalnej i hamuje aktywność
karbamoilotransferazy asparaginianowej (ATCazy). W obecności CTP enzym staje się
mniej podatny na efekty kooperatywne, ułatwiane przez związanie substratu;
Niezbędna jest większa ilość substratu do osiągnięcia danej szybkości reakcji.
ATP jest także regulatorem allosterycznym ATCazy. Jego wpływ polega
na wzroście szybkości reakcji w danym stężeniu asparaginianu.
W dużym stężeniu ATP kinetyczny profil wykazuje mniej wyraźne zachowanie
sigmoidalne.

Enzymy allosteryczne działają niezgodnie z
kinetyką Michaelisa-Menten



Enzymy allosteryczne składają się z kilku podjednostek i
kilku miejsc aktywnych.



Wykres zależności szybkości reakcji Vo od stężenia
substratu [S] często przybiera kształt sigmoidalny w
odróżnieniu od kszałtu hiperboli – dla równania Michaelisa-
Menten.



W enzymach allosterycznych, związanie substratu do
jednego miejsca aktywnego może zmienić właściwości
innych miejsc aktywnych w tej samej cząsteczce enzymu.
Rezultatem takiego oddziaływania między podjednostkami
może być kooperatywność wiązania substratu, czyli
wiązanie substratu do jednego miejsca aktywnego enzymu
ułatwia wiązanie substratu do innych miejsc aktywnych.

Jednostki enzymatyczne



Wg IUB

Jednostką (U) każdego enzymu jest

taka jego ilość, która katalizuje przemianę 1mola

substratu (lub 1mola odpowiednich grup

chemicznych) w ciągu 1 min w temp. 30

o

C i w

optymalnych warunkach (stęż. substratu, pH).



Aktywność molekularna ilość cząsteczek

substratu przekształcanych w ciągu 1 min przez 1
cząsteczkę enzymu

Jednostki enzymatyczne

Katal jest przyjętą w układzie SI jednostką aktywności
enzymu,
zdefiniowaną jako aktywność katalityczna, która
zwiększa szybkość reakcji w specyficznym układzie o
jeden mol na sekundę.

Jednostką enzymatyczną (U) jest ilość enzymu, która
katalizuje
przekształcenie1 µmola substratu w ciągu jednej
minuty w temp. 25°C, w warunkach optymalnych dla
danego enzymu.

Katal jest zbyt duży dla większości zastosowań i jest
zazwyczaj wyrażany w mikrokatalach, nanokatalach i
pikokatalach.

1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x10

6

μmol/min = 6x10

7

U

1U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16.67x10

-9

kat

Test optyczny Warburga do pomiaru
aktywności enzymów



NADH absorbcja 260 i

340

nm



NAD absorbcja 260 nm

NADH i NADPH są używane do pomiaru absorbancji w celu oznaczania enzymów:
Gdy w przebiegu reakcji powstaje NADH i NADPH
następuje wzrost absorbancji przy 340nm
Gdy w przebiegu reakcji powstaje NAD i NADP
następuje spadek ponieważ nie absorbują promieniowania przy 340nm

Zastosowanie enzymów w praktyce
medycznej:



Enzymy jako markery chorób

-

aminotransferazy (zawał mięsnia sercowego, uszkodzenie

wątroby),

-

amylaza (zapalenie trzustki)

-

LDH (zawał mieśnia sercowego)



Enzymy jako leki i odczynniki

-

Tkankowy aktywator plazminogenu i urokinaza (leczenie choroby

zakrzepowej)

-

Lipaza ( w leczeniu zaburzeń wydzielniczych trzustki

-

Ureaza ( odczynnik do oznaczania mocznika)

-

Kolagenaza (do oznaczania kolagenu w ilościach niewykrywalnych

innymi metodami, np. w hodowlach komórek in vitro.



Enzymy w biotechnologii i terapii genowej

-

Za pomocą nukleaz można wycina pewne fragmenty kwasów

nukleinowych i wszczepiać je do chorych komórek tego samego

gatunku co pozwala na wyeliminowanie wadliwie zbudowanych

odcinków DNA

Test optyczny Warburga



zasada: NADH, koenzym enzymów przenoszących

wodór, silnie pochłania światło o dług. fali 300-370

nm, natomiast jego postać utleniona - NAD nie

wykazuje w tym zakresie fali żadnej absorpcji. Na

podstawie pomiarów absorbancji w odpowiednim

paśmie (334,340 lub 366 nm) można oznaczyć

bezpośrednio przebieg utleniania lub redukcji w tej

reakcji; taka sama reguła stosuje się do NADPH;



podstawa kinetycznego pomiaru przebiegu reakcji

katalizowanych przez enzymy przenoszące proton

(tzw. test optyczny prosty) oraz w połączeniu z

reakcjami wskaźnikowymi i pomocniczymi – przez

inne enzymy, np. transferazy, kinazy i niekiedy

hydrolazy;



czas reakcji (inkubacji) – kilka minut, przebieg

kontrolowany w postaci odczytu absorbancji co 1

minutę.



Są to molekularne formy danego enzymu

powstające w wyniku ekspresji różnych genów;



Katalizują tę samą reakcję biochemiczną, ale

różnią się strukturą pierwszorzędową,

właściwościami fizycznymi, parametrami

kinetycznymi, kofaktorami, ruchliwością

elektroforetyczną, a także immunologicznie [mają

inny punkt izoelektryczny, optimum pH,

powinowactwo do substratu, inną wrażliwość na

inhibitory]. Dzięki tym różnicom izoenzymy są

lepiej przystosowane do swoistych warunków

tkankowych i przemian metabolicznych narządu

czy tkanki;



Różne formy izoenzymów danego enzymu

pochodzą zazwyczaj z różnych genów i często

występują w różnych tkankach ciała;