Pałeczki Gram-ujemne względnie beztlenowe.

Klasyfikacja Gram-ujemnych pałeczek względnie beztlenowych.

Charakterystyka:

• Pałeczki - barwiące się Gram-ujemne, ruchome. - urzęsienie

okołorzęse (rzęsek nie wytwarzają rodzaje: Klebsiella i Shigella).

Niektóre wytwarzają otoczki: np. rodzaj Klebsiella i mikrootoczki to śluz,

antygen V i występują u Salmonella typhi i niektórych gatunków

Citobacter s pp.

• Nie wytwarzają przetrwalników. Rosną w warunkach tlenowych lub względnie

beztlenowych.

• Fermentują glukozę oraz inne węglowodany. Produkty fermentacji to alkohole

i gaz lub sam alkohol.

• Pałeczki te są - katalazo-dodatnie (zdarzają się wyjątki) - oksydazo-

ujemne tzn. nie wytwarzają oksydazy-cytochromowej, redukują azotany do

azotynów, nie wytwarzają DNAzy (dezoksyrybahukleazy) wytwarza ją

jedynie Serratia spp.), niektóre wytwarzają H2S (siarkowodór) np . Proteus

spp., Salmonella spp., Citobacter spp., z wyjątkiem np. Proteus spp. nie

powodują tlenowej dezaminacji fenyloalaniny, niektóre wytwarzają ureazę

np. Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Morganella morganii, oprócz: E.

coli, K. pneumoniae, Citobacter freundii i Enterobacter spp. nie fermentują

laktozy.

• Wzrost: podłoża zwykłe, temperatura optymalna 35-37°C ( Yersinia spp. i

Erwinia spp. 22-29°C). Yersinia spp. wykazuje zdolności poruszania się w

temp. 22°C - brak poruszania w 37°C. Wzrost pałeczek w czasie 18-24

godz. (wzrost optymalny). Jedynie Yersinia spp. rośnie do 72 godz.

Diagnostyka:

Podłoża wybiórczo-różnicujące m.inn.

• MacConkey'a

• SS

• Wilson - Blaira

Niektóre szczepy mogą wytwarzać barwniki rosnąc na podłożu stałym np.

Serratia marcescens i Serratia rubidaeae wytwarzają barwnik czerwony

(prodigiozyna), a Escherichia hermanii, Enterobacter sakazakii, Xenorrhabous

luminescens (wytwarzają barwniki żółte)

1. Obserwacja ruchu -

• W probówce-podłoże półpłynne z dodatkiem TTC (chlorek

trifenylotetrazoliowy)

• posiać igiełką ezy badane szczepy drobnoustrojów przebijając całe

podłoże do dna probówki

• inkubować w cieplarce w temp. 35 - 37°C przez 24 godz.

• odczytać wynik:

• drobnoustroje wytwarzające rzęski (mające zdolności poruszania się) rosną w

całej objętości

• podłoża zmieniając jego zabarwienia na kolor ciemnoczerwony,

spowodowany rozkładem TTC

• Drobnoustroje niewytwarzające rzęsek rosną bez zmiany zabarwienia

podłoża tylko na linii

• wkłócia.

2. Preparat przyżyciowy:

• w kropli wiszącej

• na szkiełku podstawowym

Przygotować hodowlę bulionową (24 godzinna) badanego szczepu, dokładnie

odtłuścić szkiełko podstawowe za pomocą pipety przenieść 1 kroplę na szkiełko

podstawowe przykryć szkiełkiem nakrywkowym ruch drobnoustrojów oglądać pod

powiększeniem 40x

Drobnoustroje wytwarzające rzęski poruszają się ruchem „pływakowatym"

Drobnoustroje nie wytwarzające rzęsek - ruchem Browna (dookoła własnej osi).

Oznaczenie oksydazy -

1. Odczynnik - L-naftol lg rozpuszczony w C2H5OH 96%

2. Odczynnik - chlorowodorek p-aminodwumetyloaniliny lg rozpuszczony w H2O

Obecność oksydazy cytochromowej obserwowana jest jako wystąpienie

intensywnie niebieskiego zabarwienia w ciągu 30 sek do 2 min. Zabarwienie to

spowodowane jest przez błękit indotenolu, który tworzy się z dodawanych

odczynników przy obecności tlenu, cytochromu C, a także oksydazy

cytochromowej.

Oksydaza

cytochromowa

katalizuje

w

obecności

tlenu

utlenienie

zredukowanych cytochromów. Występuje u drobnoustrojów bezwzględnie

tlenowych np. Pseudomonas spp. i Micrococcus spp.

Test na oznaczenie zdolności do wykorzystania cukrów -

Odczyn 0-F(oxidation-fermentantion) na podłożu Hugh-Leifsona. Odczyn ten

służy do oznaczania zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem

kwasu w warunkach beztlenowych. Test ten wykonuje się z zastosowaniem

podłoża Hugh-Leifsona z dodanym barwnikiem (błękit bromotymolowy). Podłoże

szykowane jest-.w dwóch probówkach (zalane warstewką jałowej parafiny i bez

warstewki parafiny).

Oczkiem ezy pobrać kolonie bakteryjne i posiać na dno probówek. Następnie

jedną z nich pokryć cienką warstwą jałowej parafiny, inkubować w cieplarce i

odczytać wynik. Jeśli cukier jest wykorzystany z wytworzeniem kwasu następuje

zmiana zabarwienia podłoża z niebieskiego na żółty. Probówka z parafiną

charakteryzuje warunki beztlenowe.

Coli ID)

Jest to wybiórcze podłoże zawierające chromogeny, służące do wykrywania, oceny

ilościowej oraz różnicowania pałeczek podobnych do E. coli, a także do

identyfikacji E. coli w probówkach żywności.

Opis metody - podłoże to zawiera dwa chromogenne substraty: jeden dla B-

glukuronidazy - barwi kolonie E. coli na czerwono; drugi dla β-galaktazydazy -

barwi kolonie pałeczek podobnych do E. coli na niebiesko. Połączenie obu

substratów umożliwia jednoczesne wykrycie E. coli oraz pałeczek do niej

podobnych.

Badany materiał posiać na podłoże, inkubować 24-48 godz., 35-37°C, E. coli –

kolonie różowo-fioletowe; pałeczki podobne do E. coli - kolonie niebiesko-szare inne

bakterie Gram- ujemne - kolonie bezbarwne.

Wzrost na podłożu agarowym -

Escherichia coli rośnie w postaci kolonii gładkich lub szorstkich. Kolonie gładkie

mają szarawy odcień, są lekko wypukłe o równej krawędzi, powierzchnia kolonii jest

wilgotna i błyszcząca, łatwo zawieszają się w NaCl.

Kolonie szorstkie - powierzchnia szorstka, konsystencja sucha, trudno zawieszają

się w NaCl.

Klebsiella spp. - rosną w postaci kolonii gładkich, dużych, błyszczących, śluzowych o

barwie szarobiałej.

Enterobacter spp. - duże, białe kolonie, błyszczące, gładkie

Proteus spp. - rośnie w postaci tzw. wzrostu mgławicowego (na świeżym podłożu)

pełza pocałej objętości podłoża.

Zdolności drobnoustrojów do dekorboksylacji aminokwasów.

Podłoże to zawiera chlorowodorek pirydoksyny, odpowiedni aminokwas (np. lizynę),

purpurę bromokrezolową, czerwień krezolową. Podłoże należy rozlać do

probówek i pokryć warstewkę jałowej parafiny. Do części podłoża nie dodawać

aminokwasu (będzie to próba kontrolna), natomiast podłoże z aminokwasem (to

próba właściwa). Badane szczepy przesiać do obu probówek (jedna - kontrola i

druga - właściwa), inkubować 24 godz. w 37°C . Wynik badania - w podłożu

kontrolnym bez aminokwasu (bez lizyny) następnie rozkład glikozy, zakwaszenie

środowiska i zmiana zabarwienia z fioletowego na żółty. W drugiej probówce -(z

lizyną) wytwarza się nadmiar amin, zachodzi zobojętnienie kwaśnych produktów i

alkalizacja podłoża (wskaźnik pozostaje zabarwiony na fioletowo). Wynik dodatni -

kontrola żółta (bez lizyny), próba właściwa fioletowa (z lizyną).

Wzrost na podłożu Simmonsa z cytrymianem

Cytrynian stanowi źródło węgla. Szczepy Escherichia spp., Shigiella i niektóre

Proteus nie rozkładają go i nie wykorzystują jako źródło energii. Z tej przyczyny na

tym podłożu nie rosną. Drobnoustroje rozkładające cytrynian rosną na nim i

zmieniają jego zabarwienie. Podłoże to zawiera między innymi: NaCl, cytrynian

sodu, wodorofosforan potasu, dwuwodorofosforan amonu, siarczan magnezowy i

barwnik (błękit bromotymolowy). Badany materiał posiać ezą na podłoże, inkubować

48 godz. w 37°C. Wynik dodatni - alkalizacja podłoża (wytwarzanie NH3 z

fosforanu amonowego) i zmiana zabarwienia podłoża z zielonego na niebieskie.

Roz kład kw asu malonow ego

Jednym ze składników jest malonian s odu barwnik - błękit bromotylolowy.

Podłoże przelać do probówek, posiać badane drobnoustroje, inkubować 24

godz. w 37°C. Pałeczki rozkładające malomian alkalizują podłoże na s kutek

czego następuje zmiana zabarwienia z zielonego na niebieskie. W ynik

dodatni - niebies kie zabarwienie podłoża.

Wzrost na podłożu Wilson-Blaira -

Podłoże to zawiera - siarczyn bizmatu, zieleń brylantową, siarczan żelaza.

Kolonie szczepów Salmonella są czarne z metalicznym połyskiem

Szczepy Klebsiella - kolonie śluzowe, brunatno-szare

Escherichia coli - rośnie słabo, kolonie brązowe lub czarne, otoczenie kolonii

niezabarwione.

Enterobacter podobnie jak Klebsiella rosną obficie, kolonie, błyszczące często

śluzowate z zaczernieniem podłoża (otoczenie kolonii). Proteus - kolnie

brunatnoczerwone, szczepy Shigiellą nie rosną.

Podłoże agar SS-

Do izolowania Salmonella i Shigella podłoże to zawiera cytrynian sodu i cytrynian żelazowy, Laktozę tiosiarczanu sodu, dezoksychalan, czerwień obojętna i zieleń

brylantowa. Większość E. coli słabo rośnie, na tym podłożu, niektóre tworzą

czerwone kolonie otoczone strefą wytrąconego dezoksychalanu sodowego.

Enterobacter, Serratia, Hafnia raczej nie rosną na tym podłożu Salmonella twórzą.kolonie przejrzyste, bezbarwne, gładkie z czarnymi środkami. Shigella -

przejrzyste, bezbarwne, gładkie. Proteus - żółte z czarnymi środkami.

Podłoże Mac Conkey’a

Zawiera laktozę, sole żóici, NaCl. czerwień obojętną. Kolonie pałeczek rozkładające

laktozę rosną z czerwonym zabarwieniem, natomiast nie fermentujące jej rosną na

różowo. E. coli -kolnie różowe lub czerwone, Enterobacter aerogenes - różowe,

śluzowate Enterokoki -czerwone, małe; gronkowce - czerwone lub różowe,

Salmonella; Shigella i Pseudomonas -kolonie bezbarwne (brak fermentacji laktozy).

Wytwarzanie ureazy - rozkład mocznika na podłożu Christensena

Pałeczki należące do rodzaju Proteus i niektóre inne wytwarzają enzym ureazę,

która hydrolizuje mocznik do amoniaku (NH3) i CO2.

Amoniak alkalizuje hodowlę. Wchodzącą w skład podłoża czerwień fenolowa

zmienia zabarwienie z żółtego na różowe, (odczyn dodatni - zabarwienie różowe).

Podłoże Kliglera -

Zawiera: NaCL, siarczyn sodu, tiosiarczan sodu, siarczan żelazowy, laktozę,

glukozę, czerwień fenolową. Jest to podłoże różnicujące dla drobnoustrojów

Gram-ujemnych przewodu pokarmowego. Umożliwia obserwację zdolności

fermentowania laktozy i glukozy z wytworzeniem gazu lub bez, jak również

wytwarzanie siarkowodoru. Podłoże jałowe ma zabarwienie czerwone, zmiany

barwne:

a) żółty skos i żółty słupek podłoża - to fermentacja obu cukrów

b) niezmieniona barwa podłoża - to brak fermentacji

c) czerwony skos a żółty słupek - fermentacja jedynie glukozy

d) wytwarzanie siarkowodoru - zaczernienie podłoża

e) wytwarzanie gazu -powstawanie baniek..gazu wewnątrz..agaru,

niekiedy rozerwanie podłoża

Rozkład laktozy

Podłoże płynne z dodatkiem 10% laktozy i purpurą bromokrezolową. Niektóre

pałeczki mają zdolność beztlenowego (pod warstewką jałowej parafiny) rozkładu -

fermentacji laktozy. Podłoże ulega zakwaszeniu, a wynik reakcji obserwujemy jako

zmiany zabarwienia podłoża z fioletowego na żółtą (wynik pozytywny).

Określenie typu fermentacji - odczyn MR

W podłożu Clarka pałeczki przeprowadzające fermentację kwaśną wytwarzają z

cukrów jak i związków pokrewnych kwasy: mrówkowy, octowy, mlekowy,

bursztynowy oraz alkohol etylowy. Na skutek nagromadzenia produktów kwaśnych

odczyn hodowli wynosi pH 4,5. Wtedy czerwień metylowa będąca jednym ze

składników podłoża zmienia zabarwienie z żółtego na czerwone. W drugim typie

fermentacji, w którym powstaje mało kwasów, a więcej produktów obojętnych np.

glikol butylenowy wtedy odczyn hodowli jest mniej kwaśny (pH > 4,5) czerwień

metylowa przybiera zabarwienie żółte (odczyn ujemny). W celu odczytu wyniku

reakcji dodać tyle mililitrów odczynnika (MR) ile jest mililitrów podłoża. Czerwone

zabarwienie hodowli to - odczyn dodatni, natomiast żółte - to odczyn ujemny.

Wytwarzanie acetoiny - (odczyn Vogesa i Proskauera)

W procesie fermentacji w którym powstaje glikol butylenowy (jako główny

metabolit) powstaje także acetoina. W środowisku zasadowym przy dostępie tlenu w

obecności kreatyny albo jej pokrewnych tworzy się diacetyl o zabarwieniu różowym.

Zdolność do wytwarzania acetoiny określana jest w podłożu Clarka. Drobnoustroje

posiać do togo podłoża, inkubować 48 godz., 37°C, następnie dodać roztworom alfa-

naftolu w absolutnym C2H5OH oraz 40% wodnego roztworu KOH i roztwór kreatyny.

Probówkę umieścić w temperaturze 37°C. Czerwone lub różowe zabarwienie w

górnej części podłoża świadczy o wytwarzaniu acetoiny (odczyn-dodatni);

Wytwarzanie indolu - w podłożu woda peptonowa z tryptofanem.

Niektóre bakterie np. Escherichia, Citobacter wytwarzają indol z tryptofonu. Badany

szczep posiewać do podłoża inkubować 37°C, 24 godz. Wykrywanie indolu

pochodzącego z rozkładu tryptofanu przez enzym tryptofanaze przy użyciu

odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa. Odczynnik Ehrlicha - po podaniu eteru (eter na

powierzchni hodowli). Jeśli jest indol -przechodzi do warstwy eterowej. Odczynnik

ten nabrać pipetą i wypuścić pod warstwą eterową. Wynik dodatni - na granicy

warstwy eterowej tworzą się intensywnie czerwony pierścień.

Odczynnik Kovacsa - po podaniu tego odczynnika jeśli jest wynik pozytywny pojawia

się intensywnie czerwone zabarwienie.

Chorobotwórczość

Jej wyznacznikiem są przede wszystkim endotoksyny (LPS). Niektóre z pałeczek

jelitowych mają ponadto inne czynniki zjadliwości np. fimbrie zwykłe, a także

wytwarzanie egzotoksyny albo enzymów toksycznych. One odpowiadają za

adhezję i kolonizację, inwazyjność tzn. penetrację. Wszystkie pałeczki mogą

wywoływać poniżej podane zakażenia:

• przewodu pokarmowego - dominują Salmonella, Shigiella i E. coli,

Yersinia enterocolitica, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae,

Serratia marcescens. Zakażenia takie dotyc zą najczęś ciej jelita

cienkiego - określane są jako enterocolitis, enteritis.

• Shigella - dotyczą zakażenia błony śluzowej, jelita grubego

(czerwonka bakteryjna). Objawem zakażeń najczęściej są biegunki.

• zatrucia pokarmowe - najczęściej przez: Salmonella, Escherichia coli,

Yerinia enterocalitica np. biegunki podróżnych

• dróg moczowych - dotyczą dolnego odcinka - zapalenie pęcherza

moc zowego i c ewki moczowej, górnego - odmiedniczkowe zapalenie

nerek.

• dróg oddechowych - np. różne zapalenie płuc, rzadziej zapalenie

oskrzeli i zakażenie górnych dróg oddechowyc h, odpowiedzialne są

Klebsiella, Enterobacter, Serratia, E. coli, Citobacter, Proteus.

Cuchnąc y nieżyt nos a - Klebsiella ozaenae

• Bakterimie i posocznice - E. coli, Klebsiella pneumoniae,

Enterobacter, Serratia, Proteus , Providencia, Salmonella, Morganella

morganii. Posocznice są niejednokrotnie przyczyną zejścia śmiertelnego.

• Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych - najczęściej wywoływane

przez E. c oli (najczęś ciej u noworodków). Do zakażenia może dojść

przez powikłania w trakcie akcji porodowej. U dorosłych na drodze

krwiopoc hodnej (najczęś ciej pochodzące z pierwotnych zakażeń w

Układzie moczowym lub z dróg żółciowych). Szczepy E. coli mające

antygen powierzchniowy Kl uważane są jako bardziej zjadliwe od tych u

których ten antygen nie występuje. Ponadto inne pałeczki to: Klebsiella

(głównie K. Pnieumoniae), Enterobacter, Serratia, Proteus,

Salmonella, Yersinia, Citobac ter. Najc zęśc iej są to zakażenia wtórne

nie pierwotne, będące następs twem bakteriemii lub posocznic y.

• Układ kostno-stawowy - wywoływane najczęściej przez Yersinia, Salmonella,

E. coli.

• Zakażenia różne - np. ropnie skóry, ropnie narządów wewnętrznych

(wątroby, śledziony, nerek), ropne zapalenie pęcherzyka żółciowego lub

dróg żółciowych, zapalenie otrzewnej, odpowiedzialne są: E. c oli,

Yersinia spp., Salmonella spp., Erwinia spp., Edwards iella s pp.