Pałeczek Gram-ujemne niefermentujące glukozy.
Pałeczki niefermentujące glukozy są to pałeczki tlenowe, nie wytwarzające przetrwalników, które charakteryzuje brak zdolności fermentacji glukozy, tzn.
rozkładania glukozy bez udziału tlenu.
Klasyfikacja pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących (wybrane rodzaje) Rodzina: Pseudomonadaceae - pałeczki ruchome - rzęski
biegunowe
Rodzaj: Pseudomonas
Gatunek:
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. putida
P. stutzeri
P. mendocina
P. alcaligenes
Rodzaj: Burkholderia
Gatunek:
B. mallei
B. pseudomallei
B.
cepacia
B. picketti
B. gladioli
Rodzaj: Comamonas
Gatunek:
C. acidovorans
C. terrigena
C. testosteroni
Rodzaj: Brevundimonas
Gatunek:
B. diminuta
B. vesicularis
Rodzaj: Stenotrophomonas Gatunek:
S. maltophilia
Rodzaj: Sphingomonas
Gatunek:
S. paucimobilis
S. parapaucimobilis
S. yanoikuyae
S. adhesiva
S. capsulata
Rodzina:
Methylococcaceae
Rodzaj:
Methylobacterium
Rodzaj: Roseomonas
Rodzaj: Balneatrix
Rodzina: Alcaligenaceae - pałeczki ruchome - wkołorzese
Rodzaj: Alcaligenes
Gatunek:
A. faecalis
A. piechaudii
A. xylosoxidans spp. xylosoxidans
A. xylosoxidans spp. denitrificans
Rodzaj: Bordetella
Rodzina: Rhizobiaceae - pałeczki ruchome - wkołorzese
Rodzaj: Achromobacter
Rodzaj: Agrobacterium
Rodzaj: Ochrobactrum
Rodzaj: Oligella
Rodzina: Cytophagaceae — pałeczki nieruchome — oksydazo-
Rodzaj: Flavobacterium
Gatunek:
F. breve
F. gleum
F. indologenes
F. meningosepticum
F. odoratum
Rodzaj: Sphingobacterium
Rodzaj: Weeksella
Gatunek:
W. virosa
W. zoohelcum
Rodzaj: Moraxella
Gatunek:
M. lacunata
M.
nonliąu
efaciens
M.
osloensi
s M.
phenylp
ryuvica
M.
atlantae
Pałeczki nieruchome — oksydazo-ujemne
Rodzaj: Acinetobactęr
Gatunek:
A. calcoaceticus
A. baumannii
A. haemolyticus
A. lwoffii
A. junii
A. johnsonii
Pałeczki te są obecnie częstą przyczyną zakażeń szpitalnych pacjentów z chorobami zagrażającymi życiu i z obniżoną odpornością organizmu. Wywołują one:
• posocznice
• zakażenia układu oddechowego
• septyczne zapalenie stawów
• zakażenia układu moczowego
• pooperacyjne i pourazowe zakażenia ran
• zapalenie spojówek i inne
Miejscem ich naturalnego występowania jest woda. gleba, ścieki i żywność. Mogą rozwijać się w ubogich w składniki odżywcze środowiskach. Stanowią również składnik mikroflory skóry (pachy, pachwiny, przestrzenie międzypalcowe) i są często przenoszone na rękach pacjentów i personelu szpitalnego (Acinetobactęr!).
Charakteryzują się wieloraką opornością na antybiotyki. Niektóre (np.
Acir.etobacier) są oporne na wszystkie betalaktamy z grupy penicylin, inne (np.
Stenotrophomonas maltophilia) na imipenem lub (Burkholderia cepacia) na gentamycynę.
Identyfikacja
Uwzględnia się takie cechy biochemiczne jak:
• zdolność do fermentacji i oksydacji glukozy
• zdolność do wzrostu na podłożu Mac Conkeya (nie rosną lub wzrost zahamowany: Fłavobacterium,Moraxella)
• aktywność oksydazy cytochromowej (oksydazo-ujemne Acinetobactęr)
• ruch (ruchu nie wykazują: Acinetobactęr, Flavobacterium, Moraxella)
• wytwarzanie barwnika
• hydroliza mocznika
• redukcja azotanów
• wytwarzanie indolu
• hydroliza eskuliny
W praktyce wykorzystuje się gotowe zestawy umożliwiające identyfikację do gatunku np. API 20NE, ID 32 GN w ramach systemu ATB Expression firmy bioMerieux.
1. Pseudomonas aeruginosa
Pałeczka ropy błękitnej, tlenowa, szeroko rozpowszechniona w przyrodzie (gleba, woda, ścieki, rośliny, owady, zwierzęta), chorobotwórcza dla roślin, owadów i zwierząt.
Zakażenia przez nią wywoływane najczęściej rozpoczynają się w miejscach wilgotnych np.
• przy rurce tracheotomijnej
• cewnikach
• w miejscach oparzeń
• uchu zewnętrznym („ucho pływaka")w ranach
• zakażenia dróg moczowych
• zakażenia dolnych dróg oddechowych
• zapalenie rogówki, zakażenie wrzodu rogówki, zakażenie głębokie gałki ocznej
• bakteriemie i posocznice
• zapalenie wsierdzia
• zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
• ropnie mózgu
• zakażenia kości i/lub stawów
• endocarditis
Wytwarza barwniki fenazynowe, rozpuszczalne w wodzie i
dyfimdujące do podłoża:
• fluoresceina (piowerdyna) - barwnik fluoryzujący
• piocyjanina (barwnik niebieski)
• piorubryna (czerwony)
• melanina (brązowy)
Szczepy szpitalne Pseudomonas aeruginosa mogą nie
wytwarzać barwników!
Czynniki, które decydują o chorobotwórczości Pseudomonas aeruginosa:
• egzotoksyna A
• enterotoksyna (enteriłis, biegunka 5-dniowa w klimacie tropikalnym)
• ciepłochwiejna fosfolipaza C (lecytynaza)
• ciepłostały glikolipid wywołujący hemolizę krwinek w temp. 22-37°C
• leukocydyna (uwalniana po lizie komórek - cytotoksyczne działanie na ludzkie leukocyty)
• enzymy proteolityczne (elastaza, kolagenaza, żelatynaza, fibrynolizyna)
• otoczka alginianowa, która jest zbudowana z polimeru kwasów
marmurowego i glukuronowego. Szczepy wydzielające ten związek mają wygląd śluzowaty (połyskujący).
Rutynowa diagnostyka Pseudomonas aeruginosa
a)
posiew materiału na:
• podłoże wybiórcze z cetrymidem (bromek cetylotrójmetyloamonowy 0.02% i kwas nalidyksowy 15 mg/l jako czynniki selektywne) np. Agar Pyocyanosel bioMerieux (może służyć do bezpośredniego posiewu kału, ropy lub moczu; zalecany do wykrywania P. aeruginosa w żywności i wodzie; używany zarówno w badaniach systematycznych w warunkach szpitalnych jak i w przemyśle - skażenie
powierzchni, aparatury, przyrządów, środków antyseptycznych itd.) -
obserwacja wytworzenia piocyjaniny i fluoresceiny (w świetle lampy UV) po inkubacji 24-48 godzinnej w temp. 35°C
• podłoże King B z nitrofurantoiną (zahamowanie rozwoju większości pałeczek Gram-ujemnych) - po 24 godzinnej inkubacji w temp. 35-37°C obserwacja w świetle lampy UV zielonej, niebieskiej lub zielono-żółtej fluorescencji. Pseudomonas aeruginosa wzrasta również na zwykłym podłożu agarowym i agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej, tworząc duże, szaro-brązowo-żółte kolonie (Morfologia kolonii: S-gładka, R-szorstka, M-śluzowa). Otoczenie kolonii zazwyczaj wybarwione jest na kolor żółtozielony lub zielononiebieski. Zapach: miodu lub jaśminu (trimetyloamina).
b)
preparat barwiony metodą Grania - pałeczka Gram-ujemna wzrost w temp.
42°C w podłożu bulionowym
c)
wykrywanie piocyjaniny w podłożu płynnym - warstwa chloroformu dodanego do 24h hodowli bulionowej zabarwia się na kolor zieloniebieski; na.
powierzchni hodowli błonka
d)
wykrywanie ruchu (urzęsienie biegunowe) w półpłynnym podłożu z dodatkiem TTC (chlorek trójfenylotetrazoliwy) - wzrost i zaczerwienienie w górnej części podłoża i wzdłuż linii wkłucia (parasol)
e)
wykrywanie
oksydazy
cytochromowej
-
odczynnik
tetrametylo-p-
fenylodiamina reaguje z cytochromem c wytwarzając składnik koloru niebieskiego
•
metoda probówkowa: zawiesić badany szczep z 24h hodowli stałej
w jałowe wodzie destylowanej a następnie dodać w/w odczynnik; w
ciągu 30s do 2 min. szczep wytwarzający oksydazę powoduje
powstanie intensywnego niebieskiego zabarwienia
•
metoda bibułowa: na krążek bibuły filtracyjnej umieszczonej w
płytce Petriego nanieść 2-4 krople odczynnika a następnie za
pomocą bagietki nanieść na bibułę z odczynnikiem badany szczep
z 24h hodowli stałej; w ciągu 30s do 2 min. szczep wytwarzający
oksydazę powoduje powstanie intensywnego niebieskiego zabarwienia
•
testy komercyjne:
o Bactident Oxidase (Merck)
o Oxidase test(bioMerieux)
o Dry-slide oxidase
(Difco)
f)
rozkład glukozy (O/F) na podłożu Hugh-Leifsona zawierającym 1% glukozę oraz błękit
bromotymolowy jako wskaźnik barwny; badany szczep posiewa się do dwóch probówek
z podłożem Hugh-Leifsona, jedną z nich zalewa się jałową parafiną; inkubacja w temp.
35-37°C 24 godziny; zdolność do fermentacji glukozy (F) - zmiana zabarwienia do żółtego występuje w obu probówkach (z parafiną i bez parafiny); zdolność do oksydacji glukozy (O) - zmiana zabarwienia do żółtego tylko w probówce
bez parafiny
Psedomonas aeruginosa powoduje oksydację glukozy, czyli nastąpi zmiana zabarwienia
tylko w probówce bez parafiny.
g)
redukcja azotanów do azotynów - na podłożu o specjalnym składzie w obecności odczynników: a-naftolu w lodowatym kwasie octowym i kwasu sulfanilowego w lodowatym kwasie octowym;
• zdolność redukcji azotanów do azotynów - powstanie czerwonego
zabarwienia w ciągu
• 5 minut;
• zdolność redukcji azotanów do wolnego azotu - brak czerwonego
zabarwienia po
• dodaniu sproszkowanego cynku, gdy nie wystąpiła w/w reakcja;
• brak zdolności redukcji azotanów do azotynów - czerwone zabarwienie po dodaniu
• sproszkowanego cynku
Pseudomonas aeruginosa redukuje azotany do wolnego azotu, ale niektóre szczepy mogą redukować azotany do azotynów.
h)
wytw arzanie dihydrolazy argininy: enzym rozkłada argininę do omityny, amoniaku i CO2, co powoduje wzrost pH (zmiana zabarwienia wskaźnika-czerwieni fenolowej z żółtej na czerwoną)
i)
redukcja TTC: powstaje czerwony strat (formazon) w hodowli płynnej lub czerwono zabarwione kolonie na podłożu agarowym
j)
identyfikacja do gatunku za pomocą biochemicznych mikrotestów komercyjnych: API 20 NE i ID 32 GN w ramach systemu ATB
Expression (bioMerieux)
k)
typowanie pałeczek P. aeruginosa dla celów epidemiologicznych (identyfikacja wewnątragatunkowa): serologiczne, bakteriofagowe, bakteriocynowe (piocynowe), biochemiczne, enzymatyczne, genetyczne.
Pałeczki P. aeruginosa charakteryzuje naturalna oporność na liczne leki (penicylina G, ampicylina, cefalosporyny I—II generacji, tetracykliny, linkozamidy, stare chinolbny). Aktywne mogą być: karbenicylina, tikarcylina, ureidopenicyliny (piperacylina), aztreonam (monobaktamy), ceftazydym i cefoperazon
(cefalosporyny III generacji),
cefpirom (IV generacja
cefalosporyn), imipenem i meropenem (karbapenemy),
Timentin i Tazocin (preparaty skojarzone), aminoglikozydy i fluorochinolony (wysokie odsetki szczepów opornych).
2. Acinetobacter sp.
Gram-ujemna ziarniako-podobna-pałeczka, tlenowa, szeroko rozpowszechniona w przyrodzie (środowisko wodne, gleba, żywność, u ludzi i zwierząt). U człowieka bytuje na skórze (pachy, pachwiny, przestrzenie między palcami nóg), rzadziej kolonizuje przewód pokarmowy, jamę nosowo-gardłową i pochwę.
Wywołuje zakażenia u chorych o zmniejszonej odporności, po zabiegach inwazyjnych, ciężkich i
Długotrwałych zabiegach chirurgicznych. Jest to drobnoustrój powodujący typowe zakażenia szpitalne. Może wywoływać:
• zakażenia dolnych dróg oddechowych (chorzy intubowani)
• bakteriemie i posocznice
• zapalenie otrzewnej (u chorych dializowanych)
• zakażenia układu moczowego (chorzy z cewnikami założonymi na stałe)
• zapalenie opon mózgowych (po zabiegach neurochirurgicznych)
• zapalenie spojówek i/lub gałki ocznej
• zapalenie wsierdzia
• zapalenie stawów, kości i szpiku
• zakażenia skóry i ran
Nie wytwarza barwników (obserwowano powstawanie brązowego barwnika przechodzącego do podłoża wyłącznie na agarze z wyciągiem z serca wołowego).
Diagnostyka:
• preparat barwiony metodą Grama - Gram-ujemna ziamiako-podobna-paleczka
• dobrze rośnie na podłożu Mac Conkeya (z wyjątkiem nielicznych szczepów A.
lwoffii), na zwykłym podłożu agarowym i na podłożu agarowym z krwią
• nie wykazuje ruchu (brak urzęsienia)
• oksydazo-ujemna
• rozkład tlenowy glukozy na podłóżu:. Hugh-Leifsona
• brak zdolności redukcji azotanów do azotynów
• nie wytwarza dihydrolazy argininy
W identyfikacji do gatunku wykorzystuje się testy fenotypowe, np. API 20 NE lub ID
32 GN bioMerieux. Obecnie wyróżnia się 12 gatunków genetycznych wyodrębnionych dzięki technice hybrydyzacji DNA-DŃA. Z materiałów klinicznych najczęściej izoluje się gatunek A. baumannii, natomiast rzadziej inne gatunki: A. lwoffii, A. johnsonii, A.
junii, A. haemolyticus.
Acinetobacter baumannii charakteryzuje wieloraka oporność na antybiotyki.
Aktywne mogą być nieliczne leki, m.in. ceftazydym, imipenem i meropenem, fluorochinolony oraz skojarzenia ceftazydymu i cefotaksymu z aminoglikozydami lub fluorochinolonami.