Metody diagnostyki cytogenetycznej należy dobrać pod kątem sytuacji klinicznej, a wynik interpretować indywidualnie. W przypadku dzieci z dysmorfią oraz par małżeńskich z niepowodzeniami rozrodu należy analizować chromosomy dość długie i o dobrym wzorze prążkowym, a przy podejrzeniu zespołów mikrodelecji metodą z wyboru jest analiza chromosomów prometafazowych, bardzo długich, na których można uwidocznić poszczególne subprążki [25, 49].
Metody klasycznej cytogenetyki są również uzupełniane technikami biologii molekularnej - stąd nazwa "cytogenetyka molekularna". FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ), w której stosuje się odpowiednio dobrane sondy molekularne jest znacznie czulsza niż klasyczne techniki cytogenetyczne, pozwala na wykrywanie submikroskopowych aberracji chromosomowych i umożliwia właściwe rozpoznanie cytogenetyczne w przypadkach, w których zawodzą techniki cytogenetyki klasycznej [3, 50]. FISH umożliwia także wykrywanie niektórych aberracji (zwłaszcza aberracji liczby chromosomów) bez potrzeby uwidaczniania chromosomów, tj. w jądrach interfazowych.
Metodyka badania kariotypu:Zazwyczaj, badania cytogenetyczne wykonywane są na podstawie hodowli limfocytów krwi obwodowej (krew zostaje pobrana jałowo na heparynę). Niejednokrotnie jednak, zwłaszcza przy podejrzeniu mozaikowości, wykonuje się badania na podstawie komórek innych tkanek - np. fibroblastów. Oczywiście w przypadku diagnostyki prenatalnej materiał do badania kariotypu stanowią komórki pochodzenia płodowego - pochodzące z płynu owodniowego lub kosmówki.
Hodowle limfocytów zakładane są na płynnym podłożu hodowlanym z dodatkiem antybiotyku i mitogenu. Po 72 godzinach hodowli, limfocyty poddawane są działaniu kolchicyny w celu zahamowania podziałów w wymaganej fazie podziału komórki (metafazie). Następnie traktowane są roztworem hipotonicznym celem rozrzucenia chromosomów oraz utrwalane.
Rutynowo, badane są zazwyczaj chromosomy metafazowe, trawione trypsyną i barwione przy pomocy barwnika Giemsy (technika GTG). Metoda ta nazywana jest techniką barwienia G, a ich efektem są tzw. prążki G.
Istnieją również popularne techniki barwienia chromosomów, ujawniające inny wzór prążkowy, np. tzw. prążki R (odwrotne), prążki Q (z zastosowaniem quinakryny), prążki C (uwidaczniające heterochromatynę konstytutywną), prążki T (uwidaczniające telomery) oraz technika NOR (uwidaczniająca organizatory jąderka).
Aby uzyskać większą rozdzielczość prążkową obrazu chromosomów, stosowane są techniki prążkowania o wysokiej rozdzielczości (oznaczane skrótem HRBT lub HRB, od ang. high resolution banding technique). Analizie poddawane są wówczas chromosomy prometafazowe lub nawet późnoprofazowe, tj. takie, których kondensacja nie została jeszcze ukończona. Uzyskać można wówczas, zamiast 350-400 prążków chromosomów metafazowych, nawet 850-900 lub więcej prążków na haploidalny zestaw chromosomów. Pozwala to na wykrycie nawet małych aberracji strukturalnych chromosomów.
Diagnostyka najmniejszych aberracji struktury oraz szybka diagnostyka aberracji liczbowych wymaga stosowania techniki łączącej metody cytogenetyki i biologii molekularnej. Jest nią fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescence in situ hybridization, FISH).
W uproszczeniu, technika ta polega na hybrydyzacji sondy molekularnej wyznakowanej barwnikiem fluorescencyjnym (fluorochromem) z analizowanym fragmentem chromosomu. Następnie, w mikroskopie optycznym poszukiwany jest na preparacie cytogenetycznym sygnał fluorescencyjny pochodzący od sondy molekularnej. Systemy komputerowej analizy obrazu mikroskopowego pozwalają obecnie nawet na jednoczesne użycie wielu sond wybarwianych różnobarwnymi fluorochromami oraz wzmacnianie słabych sygnałów fluorescencyjnych pochodzących od małych sond molekularnych.
Cytogenetyka - dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów. Cytogenetyka koncentruje się zarówno na kształcie jak i liczbie chromosomów, jak również na ich dziedziczeniu. W ostatnich latach rozwinęła się cytogenetyka molekularna, umożliwiająca badanie materiału genetycznego w stadium interfazy, bez uformowanych chromosomów.
Klasyczne badanie cytogenetyczne opiera się na analizie chromosomów w stadium metafazy, po ich ewentualnym uprzednim wytrawieniu trypsyną i zabarwieniu. W wyniku barwienia uzyskuje się obraz ciemniejszych i jaśniejszych prążków, charakterystyczny dla danego chromosomu. Do najczęściej stosowanych metod barwienia należą:
Prążki Q - uzyskuje się je w wyniku zabarwienia chromosomów kwinakryną, będącą barwnikiem fluorescencyjnym
Prążki G - powstają w wyniku potraktowania badanego materiału barwnikiem Giemsy
Prążki R - obraz tych prążków jest odwrotny do uzyskanego w wyniku barwienia odczynnikiem Giemsy
Prążki C - uwidacznia heterochromatynę konstytutywną
Prążki T - uwidacznia telomery
NOR - pozwala na analizę organizatorów jąderka.
W przypadku, gdy chromosomy barwione są technikami nie pozwalającymi na uzyskanie wzoru prążkowego, ich analiza opiera się na klasyfikacji do jednej z 7 grup, na podstawie długości i położenia centromeru [1].
Grupa A (chromosomy 1 - 3): duże chromosomy metacentryczne
Grupa B (4 - 5): duże chromosomy submetacentryczne
Grupa C (6 - 12, X): chromosomy metacentryczne lub submetacentryczne, pośredniej długości
Grupa D (13 - 15): pośredniej długości chromosomy akrocentryczne z satelitami
Grupa E (16 - 18): krótkie chromosomy metacentryczne lub submetacentryczne
Grupa F (19 - 20): bardzo krótkie chromosomy metacentryczne
Wszelkie nazewnictwo cytogenetyczne regulowane jest przez Międzynarodowy System Nazewnictwa Cytogenetycznego (International System for Human Cytogenetic Nomenclature)[1]. Określenie pozycji w obrębie prążka na chromosomie wymaga podania numeru chromosomu, następnie ramienia (p - ramię krótkie lub q - ramię długie), numeru regionu i numeru prążka. Regiony leżące najbliżej centromeru noszą numer 1, oddalające się w kierunku telomerów - kolejne numery. Dla przykładu zapis 4q31 oznacza chromosom 4, ramię długie, region 3 i prążek 1. Dokładniejsze pozycje podaje się po kropce, np. 4q31.1, 4q31.2, 4q31.3.
Zapis kariotypu :Klasyczne badanie cytogenetyczne kończy się zapisaniem kariotypu. Prawidłowy kariotyp żeński to 46,XX, kariotyp męski 46,XY. Wszelkie odchylenia od wyników prawidłowych zapisywane są przy użyciu szeregu skrótów, np. t (translokacja), del (delecja), inv (inwersja). Przykładowo, 46,XX,t(2;10)(p21;q24) oznacza kobietę z translokacją zrównoważoną pomiędzy krótkim ramieniem chromosomu 2 (miejsce pęknięcia p21), a długim ramieniem chromosomu 10 (pęknięcie w miejscu q24). Dodatkowe chromosomy w kariotypie podaje się po znaku +, np. 47,XY,+21 oznacza osobnika płci męskiej z dodatkowym chromosomem 21 (trisomia 21, zespół Downa).
Zastosowanie klasycznych badań cytogenetycznych :Badanie chromosomów metafazowych przeprowadza się m.in. w przypadkach:
podejrzenia wystąpienia u dziecka choroby genetycznej, której podłożem mogłoby być zaburzenie w liczbie lub strukturze chromosomów - w takim przypadku konieczne jest również przebadanie najbliższych członków rodziny, celem potwierdzenia lub wykluczenia nosicielstwa np. translokacji
niepowodzeń rozrodu - nieprawidłowy kariotyp któregoś z rodziców może być przyczyną nawykowych poronień
badań prenatalnych - wiek matki (po 37 roku życia) może predysponować do wystąpienia aneuploidii u dziecka (np. zespołu Downa)
wystąpienia niektórych chorób nowotworowych - nieprawidłowy kariotyp w komórkach guza może ułatwić jego identyfikację i leczenie (cytogenetyka onkologiczna)
Technika wykonania badań :Wykonanie badania cytogenetycznego opiera się na przeprowadzeniu hodowli in vitro komórek, których chromosomy będą następnie poddane badaniu. Najczęściej są to limfocyty krwi obwodowej, amniocyty, komórki guza, rzadziej fibroblasty. W celu zatrzymania podziałów komórkowych na etapie metafazy do hodowli dodaje się kolchicynę, bądź jej pochodne. Powoduje to zahamowanie tworzenia wrzeciona kariokinetycznego. Następnie komórki są utrwalane, barwione w formie preparatu na szkiełku mikroskopowym i poddawane analizie mikroskopowej.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ:Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ (FISH z ang. fluorescent in situ hybridization) jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. W celu analizy badanego materiału konieczne jest użycie mikroskopii fluorescencyjnej.
Technika :Najczęściej odpowiednie przygotowanie komórek do badania polega na usunięciu cytoplazmy i utrwaleniu jąder komórkowych na szkiełku podstawowym. Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całość podawana jest krótkotrwałej denaturacji w podwyższonej temperaturze, a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Kolejnym etapem jest usunięcie nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy przez kilkukrotne odpłukanie preparatu i uwidocznienie jąder komórkowych barwnikiem specyficznym dla DNA (przeważnie stosowany jest DAPI). Tak przygotowany preparat można analizować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Popularnymi znacznikami fluorescencyjnymi, używanymi do znakowania sond są rodamina i fluoresceina, a także kumaryna.
Zastosowanie]:Technika FISH może być wykorzystana do badania wielu typów komórek i tkanek. Mogą to być limfocyty (jądra metafazowe oraz interfazowe) uzyskane w wyniku hodowli komórkowej, jak również w bezpośrednim rozmazie krwi, rozmazy szpiku kostnego, preparaty moczu, komórki guzów nowotworowych, blastomery, polocyty, czy amniocyty. Możliwa jest także analiza jąder z tkanek zabezpieczonych w blokach parafinowych. Technikę FISH stosuje się chętnie w przypadkach, gdy zawodzi klasyczna analiza cytogenetyczna, innymi słowy gdy w badaniu kariotypu niemożliwe jest ustalenie dokładnego rodzaju bądź miejsca powstania mutacji w genomie. Zastosowanie unikalnych sond umożliwia zlokalizowanie miejsc pęknięć chromosomów czy określenie rodzaju translokacji. FISH jest również narzędziem w badaniu anomalii genetycznych, będących markerami nowotworów (cytogenetyka onkologiczna). Metoda ta, obok techniki PCR, jest także nieocenioną pomocą w diagnostyce preimplantacyjnej, gdzie badanie pojedynczej komórki polocytu czy blastomeru pozwala uniknąć podania zarodka, któremu jeden lub oboje rodzice przekazali określone wady genetyczne (zobacz: zapłodnienie in vitro). W badaniach prenatalnych z wykorzystaniem amniocytów jako analizowanego materiału, możliwe jest określenie wady genetycznej płodu.
Hybrydyzacja fluorescencyjna jest także z powodzeniem wykorzystywana do detekcji mikroorganizmów w materiale biologiczny
Streszczenie
Techniki takie jak FiSH, MFisH, SKY czy analiza cytometryczna, znalazły szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach medycyny. Stały się narzędziami, służącymi do diagnozowania nie tylko zespołów genetycznych (takich jak zespołu Williamsa, Rubinstein-Taybiego, Wolfa-Hirshhorna) w okresie życia płodowego czy dzieciństwa, ale także określenia typu nowotworu i identyfikacji jego leczenia czy screeningu niektórych chorób.
Hybrydyzacja in situ oznacza wykrywanie określonych sekwencji przy pomocy sond molekularnych, komplementarnych do fragmentów DNA, które niejako „rozpoznają” określone regiony chromosomów, dzięki czemu powstają kompleksy DNA. W zależności od typu sondy można rozpoznać różne fragmenty chromosomów, określić ich wielkość lub wyznakować całe chromosomy. Znacznikami mogą być sondy fluorochromowe (technika FiSH) lub sonda modyfikowana chemicznie przez np. biotyny [1]. Po wybarwieniu dochodzi do oceny barwy światła przy pomocy spektrofotometrycznej analizy widma emitowanego światła oraz analizie i przetworzeniu tych danych.
Zastosowanie techniki FISH:
1. Diagnostyka u pacjentów z podejrzeniem niektórych zespołów lub zaburzeń o podłożu genetycznym:
a. technika diagnostyczna z wyboru dla m.in. zespołu Williamsa, Rubinstein-Taybiego, Wolfa-Hirshhorna, Prader-Willego.
b. diagnostyka przyczyn niepełnosprawności umysłowej (50% niepełnosprawności umysłowej spowodowana jest wadami genetycznymi [2]
c. zaburzenia różnicowania płciowego, obojnactwo i dysgenezje gonad etc.
2. Medycyna prenatalna - diagnostyka zaburzeń oraz screening - kilka sond służy do diagnostyki aneuploidii chromosomów 21, 13, 18, X i Y w badaniach prenatalnych
3. Diagnostyka genetyczna oraz leczenie i jego modyfikacja w przypadku chorób nowotworowych - np. ocena liczby kopii danego genu w komórkach nowotworowych (np. analiza genu HER2 w przypadku raka piersi, w kontekście modyfikacji dalszego leczenia [3,4]
4. Identyfikacja drobnoustrojów w materiale biologicznym u pacjenta lub jako metoda skreeningowa zakażenia np. Metoda FiSH, ze względu na swoją wysoką wrażliwość i wysoką specyficzność, pozwala szybko zidentyfikować w materiale pobranych z dróg oddechowych typ bakterii Achromobacter xylosoxidans oraz Alcaligenes faecalis. [5]
Warunkiem wykonania badania jest znajomość miejsca aberracji - sonda musi być SPECYFICZNA, np. w przypadku diagnostyki mikrodelecji, identyfikacji zespołu Rubinstein-Taybiego do regionu del 16p13.3, w zespole Prader- Willie del 15q12 itd.
Modyfikacją metody FiSH jest tzw. Multikolor FiSH (M-FISH), polegająca na barwieniu każdej pary chromosomów w taki sposób, aby fluoryzowały innym kolorem. Następnie poddawane są analizie komputerowej i otrzymuje się pełen panel 23 par chromosomów.
Warto wspomnieć w tym miejscu o technice molekularnego kariotypowania tzw. spectral karyotyping, czyli SKY, analiza widmowa kariotypu [1,7]. SKY to odmiana MFisH . Molekularne kariotypowanie to zmodyfikowana technika FISH (Fluorescent in situ hybridization), polegającą na wybarwianiu odpowiednich regionów chromosomów przy pomocy komplementarnych sond molekularnych, wyznakowanych fluorochromem. Otrzymujemy zatem wielokolorowy obraz kariotypu, co pozwala na analizę poszczególnych chromosomów (każda para chromosomów ma inną barwę). Ograniczeniem tradycyjnej techniki jest rozdzielczość ok 5 Mb (megapar zasad) - zatem mniejsze zmiany w badanych chromosomach mogą zostać przeoczone, SKY natomiast umożliwia identyfikację mniejszych aberracji chromosomowych. W badaniach komórek nowotworowych uzyskuje sie informacje o nowych, ale też "ukrytych" translokacjach, złożonych rearanżacjach oraz o tzw. "jumping translocations". Wyniki badań SKY można umieszczać w interaktywnej bazie danych, która ułatwia analizę danych (SKY, M-FISH and CGH), wyszukiwanie informacji na temat aberracji chromosomowych w nowotworach lub chorobach konstytucyjnych (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi) [7].
Naturalnie wadą wspominanych metod jest oczywiście wysoki koszt aparatury oraz oprogramowania komputerowego, a także konieczność współpracy z wykwalifikowanym personelem laboratoryjnym (nieczytelne badanie SKY lub źle przygotowany preparat np. nadmiar cytoplazmy otaczającej chromosomy, może uniemożliwić optymalne odczytanie badania); zaletą natomiast wysoka rozdzielczość badań.
W przypadku nieznajomości aberracji lub ich lokalizacji w genomie można zastosować inną metodę tzw. metodę porównawczej hybrydyzacji genomowej CGH (czyli comparative genomic hybridization), polegająca na pomiarze różnic ilości kopii DNA w próbce genomu oraz w DNA referencyjnym. CGH najczęściej znajduje zastosowanie w onkologii - wyobraźmy sobie eksperyment, w którym DNA komórek nowotworowych znakowany jest biotyną, natomiast DNA prawidłowe digoksygeniną (DNA referencyjne) i oba materiały zostały hybrydyzowane do chromosomów metafazowych. Wizualizacja DNA w tym eksperymencie następuje odpowiednio fluoresceiną oraz rodaminą i wykrywana w mikroskopie elektronowym. Wykonanie obrazu za pomocą CCD-kamery i obróbka obrazu, pozwalająca ilościowo określić zawartość DNA w chromosomach.
Do czego służy analiza cytometryczna?
Badanie polega na określeniu zawartości DNA lub stosunku par zasad AT/CG w poszczególnych chromosomach. Znajduje to zastosowanie w wykrywaniu aberracji liczbowych i aberracji strukturalnych, objawiających się zmianą ilościową zawartości DNA w chromosomach.
Izolacja, barwienie bromkiem etydyny lub dwoma fluorochromami specyficznymi dla par zasad AT lub GC poprzedza przepuszczanie przez wiązkę laserową, co wzbudza fluorescencję. Metoda ma szereg zalet - jest szybka i precyzyjna, zautomatyzowana. Do wad należy zaliczyć brak możliwości identyfikacji chromosomów 9-12 oraz trudności w przypadku heteromorfizmu chromosomów.
Główne zastosowanie analizy cytometrycznej to sporządzanie bibliotek fragmentów DNA specyficznych dla poszczególnych fragmentów. Analiza cytometryczna służy także do lepszego poznawania biologii molekularnej nowotworów, poprzez porównawczą analizę ploidii komórek nowotworowych i korelacją jej z obrazem klinicznym (6).
Identyfikacja chromatyny płciowej:
Analiza chromatyny płciowej - żeńska to ciałko Barra, chromatyna X; męska to ciałko Y, w ostatnim czasie została wyparta przez nowocześniejsze metody diagnostyczne określania płci. Ma obecnie niewielkie zastosowanie praktyczne.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych to zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych. Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie, czyli ulegają renaturacji. Jeśli do takiej mieszaniny wprowadzi się obce nici kwasu nukleinowego, oprócz wyjściowych cząsteczek powstaną cząsteczki hybrydowe, stąd nazwa hybrydyzacja. Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.
Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:
poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.
do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję cząsteczek mRNA w technice northern.
do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.
do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice hybrydyzacji in situ.
do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southerna, np. w celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). Techniki RFLP używa się m. in. celu ustalenia ojcostwa.
W przeszłości, prędkość hybrydyzacji DNA wyizolowanego z genomów dwóch różnych organizmów była używana jako miara pokrewieństwa ewolucyjnego. W ten sposób na przykład ustalono po raz pierwszy, że szympans jest najbliższym ewolucyjnie krewniakiem człowieka.
Translokacja robertsonowska: łącza się całe lub prawie całe ramiona długie chromosomów. Miejscem połączenia jest rejon centromeru. Dochodzi do utraty ramion krótkich. W kariotypie stwierdza się brak chromosomu.