1. Metody badań aktywności enzymów.

Oznaczenie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne

Stosuje się metodę Ansona, która opiera się na procesie hydrolizy zdenaturowanej hemoglobiny jako substratu. Na podstawie różnicy ilości PBH (produktów hydrolizy białka) w przesączach, otrzymanych po strąceniu roztworów 10% TCA, określa się aktywność proteolityczną badanego enzymu.

2. Jednostki aktywności enzymów.

Jednostka enzymu (jednostka enzymatyczna), U (ang. unit, w pol. także J) - jednostka aktywności enzymów[1] wprowadzona w 1964 przez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej. Zdefiniowana przez Komisję Enzymową w 1961.

Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu w czasie 1 minuty. Zwykle przyjmuje się określone warunki: temperaturę 30 °C, dane pH i maksymalne wysycenie enzymu substratem.

Ponieważ minuta nie jest jednostką SI, do określania aktywności enzymów zaleca się stosowanie katala (od 1978).

1 U = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala.

Jednostka enzymu U, nie ma nic wspólnego z IU (International Unit; Jednostka Międzynarodowa), miarą aktywności substancji biologicznie czynnych.

3. Metody oznaczania stężenia białka i produktów hydrolizy białka..

Badanie ilości produktów hydrolizy białka prowadzi się najczęściej metodą Lowry'ego. Jest to metoda kolorymetryczna, w której końcowa barwa jest wynikiem po pierwsze, reakcji biuretowej białka z jonami miedzi w środowisku zasadowym, czyli przyłączenia jonów miedzi do wiązań peptydowych, po drugie, redukcji odczynnika fosfomolibdeno-fosfowolframowego (odczynnik Folina-Ciocalteu) przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan (redukcję barwy powodują także związane już jony miedzi, natomiast barwa powstająca przy nieobecności jonów miedzi pochodzi tylko od aminokwasów).

Oznaczanie stężenia białka metodą biuretową: Do kolbek odmierzyć po 0,5 cm³ kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody destylowanej), dodać po 2 cm³ odczynnika miedziowego (wszystkie próby w 3 powtórzeniach). Po 30 min odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej (po uwzględnieniu zmętnienia), następnie zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie

1. Metody izolacji i oczyszczania enzymów.

Enzymy są przeważnie bardzo nietrwałe w środowisku o pH mniejszym niż 5 lub większym niż 9, łatwo ulegają też denaturacji cieplnej (powierzchniowej - podczas pienienia się roztworów) oraz są inaktywowane przez metale ciężkie.

Izolowanie i oczyszczanie enzymów należy zatem przeprowadzać w taki sposób, aby zapobiegać utracie zdolności katalitycznych, tzn.

• w buforach o pH około 7,

• - w niskiej temperaturze (najczęściej około 0^oC),

• stosując wodę podwójnie destylowaną oraz

• środki kompleksujące metale ciężkie, a w razie konieczności również związki tiulowe,

• zachowując wyjątkową czystość na stanowisku pracy.

Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne.

1. Pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak: -degradacja ścian komórkowych przez lizozym, rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego,

-sonifikacja (pękanie komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradźwiękami) oraz -homogenizacja,

-rozcieranie z piaskiem lub perełkami szklanymi i inne metody mechaniczne.

Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy.

Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo różnorodne i ich stosowanie zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia enzymu.

2) Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:

- frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)

- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).

Metody te opieraja się na odciągnięciu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworza białka (w tym enzymy)

ponieważ białka są cząsteczka zawieraja różne ilości gr kwas i zasad ich rozpuszczanie zalezy od stęż soli, polarnosci i pH rozpuszczalnika i temp. Dlatego pewne białak wypadaja z roztrorów, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny .

Otrzymane osady białkkowe oddziela się przez wirowanie lub stosuje metody filtracyjne. Następnie są rozpuszczane a w przypadku wykorzystania procesu wysalania mogą być poddawane dializie.

1. Jako kolejny etap otrzymywania enzymów, szerokie zastosowanie ma obecnie -chromatografia,

-elektroforeza,

-ultrawirowanie,

-stosowana jest także krystalizacja.

Duże znaczenie w procesach oczyszczania białek mają techniki elektroforetyczne. Podobnie jak metody chromatograficzne mają one zastosowanie w przypadku wykonywania badań analitycznych (np. określania stopnia czystości izolowanych enzymów) jak i badań preparatywnych, wykonywanych w celu oczyszczenia białka.

Ultrawirowanie wykorzystuje znacznie wyższe przeciążenia (nawet powyżej 600 000 x g). W przypadku stosowania ultrawirowania w celach preparatywnych zazwyczaj prowadzi się ten proces w obecności substancji, która pozwala na otrzymanie gradientu gęstości. W obecności CsCl lub sacharozy gęstość roztworu wzrasta od powierzchni do dna naczyń wirówkowych, co pozwala na zwiększenie wydajności rozdziałów prowadzonych metodami ultrawirowania.

1. Proces oczyszczania enzymów wymaga ciągłej kontroli zarówno

-jakościowej (wzrastająca czystość białka),

-jak i ilościowej (badanie stężenia interesującego enzymu i/lub jego aktywności).

Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Do oznaczania stężenia enzymów wykorzystywane są natomiast zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, np. metoda Lowry'ego, metoda biuretowa. Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne.

2. Warunki niezbędne do uzyskania aktywnych enzymów.

Oznaczenie aktywności enzymw wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne

3. Źródła enzymów stosowanych w technologii żywności.

Źródłem enzymów mogą być tkanki roślinne, zwierzęce oraz komórki mikroorganizmów. Obecnie szerokie zastosowanie znajdują zwłaszcza enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, ze względu na łatwość uzyskania dużych ilości homogennych enzymów.

2. Inwertaza i oksydaza glukozowa.

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych.

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci stałej (głównym składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w ciągu kilkutygodniowego „dojrzewania“ czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej w procesie produkcji, sacharoza rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć ze środowiska powodują w efekcie upłynnienie nadzienia.

Oksydaza glukozowa utlenia glukozę do kwasu glukozowego. Enzym ten wykazuje powinowactwo do β-D-glukopiranozy. Oksydazę glukozową stosuje się do ilościowego oznaczania glukozy w żywności, we krwi i w moczu, a także do usuwania glukozy z produktów spożywczych oraz do usuwania tlenu z puszek z konserwami, piwem czy też z opakowań foliowych.

1. Enzymy proteolityczne, amylolityczne, lipolityczne.

-Enzymy proteolityczne, czyli trawiące białko. Należą do nich: trypsyna, chymotrypsyna, karboksypeptydazy A i B, elastaza, nukleaza.
- Enzymy lipolityczne, czyli trawiące tłuszcze. Należą do nich: lipaza trzustkowa, fosfolipazy A i B, esterazy.
- Enzymy amylolityczne (glikolityczne), czyli trawiące skrobię. Jest to alfa-amylaza trzustkowa.

2. Preparaty enzymatyczne.

∙Proteopol BP-S jest preparatem enzymatycznym zawierającym enzymy proteolityczne, otrzymywane w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis. Enzymy te hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowiskach o odczynie zbliżonym do obojętnego. Stosowany jest w produkcji pieczywa cukierniczego - do częściowej biodegradacji glutenu mąki przy wyrobie kruchych ciast cukierniczych (krakersy, wafle), gdzie umożliwia otrzymanie jednorodnej, kruchej, lekko łamliwej konsystencji wypieku, oraz w produkcji piwa, jako uzupełnienie enzymów proteolitycznych słodu lub ich częściowe zastąpienie przy przerobie zbożowych surowców niesłodowanych.

∙Amylopol P jest skoncentrowanym preparatem enzymatycznym zawierającym kompleks enzymów amylolitycznych, proteolitycznych i celulolitycznych otrzymywanym w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu Aspergillus oryzae. Przeznaczony jest do likwidacji zmętnień skrobiowych, białkowych i śluzowych w surowych ekstraktach kawy zbożowej przed koncentracją i suszeniem oraz do wstępnej hydrolizy skrobi przy produkcji syropów ziemniaczanych. Stosowany jest do likwidacji zmętnień skrobiowych, białkowych i śluzowych w surowych ekstraktach kawy zbożowej przed koncentracją oraz do wstępnej hydrolizy skrobi zawartej w surowcach roślinnych (zboża, ziemniaki).

Preparaty enzymatyczne- uzyskuje się przez dalsze rozcieńczanie koncentratów lub zmieszanie wyizolowanych enzymów bądź koncentratów enzymatycznych

Wyróżniamy:

-ciekłe preparaty enzymatyczne -ultrafiltracja, odparowanie próżniowe

-stałe preparaty enzymatyczne - suszenie próżniowe rozpyłowe lub liofilizacja

3. Zastosowanie enzymów w przemyśle spożywczym.

---