PORÓWNANIE ILOŚCI I JAKOŚCI DNA

METODY BADANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH:

1. TECHNIKI MIKROSKOPOWE

A. MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Mikroskop elektronowy jest urządzeniem, którego zakres rozdzielczości wynosi 0,2-20 nm, co umożliwia oglądanie organelli komórkowych, wirusów i makrocząsteczek biologicznych (np. DNA), niemniej jednak ograniczeniem mikroskopu elektronowego jest brak możliwość oglądania próbek materii żywej.

Najbardziej popularną techniką uwidaczniania DNA jest metoda Klein-Schmidta. W tej technice kroplę roztworu DNA w octanie amonu zawierającym cytochrom c, nanosi się na powierzchnię octanu amonu. Po dotknięciu przez kroplę powierzchni, tworzy się na niej cienki film zdenturowanego cytochromu c. Film ten zawiera pewną ilość cząsteczek DNA, do której przyłącza się cienka warstwa cytochromu. Jeżeli do tego filmu zostanie przyłożony mały obiekt kulisty, to dołączy się do niego kropla zawierająca część filmu. Usunięcie fazy wodnej np. poprzez zanurzenie w alkoholu, spowoduje stabilne przyleganie warstwy do filmu pokrywającego kulisty obiekt. Technika ta zawiera wstępne barwienie pozytywne, np. octanem uranu. Metoda ta jest stosowana do określania długości i formy DNA. Zmodyfikowana metoda Klein-Schmidta pozwala natomiast zlokalizować specyficzne obszary w DNA m.in. określić pozycje końców liniowego DNA w formie kolistej, identyfikować bardzo długie cząsteczki izolowane z E.coli zainfekowanych fagiem λ oraz określić kierunek replikacji DNA faga λ.

B. SKANINGOWA MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala na badanie cech strukturalnych obiektów biologicznych o wymiarach 3-20 nm w buforach czy w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Znalazła ona zastosowanie w badaniach nad zginaniem DNA na skutek różnych oddziaływań z białkami, oddziaływaniem przeciwciał z różnymi formami DNA, w analizie relacji stechiometrycznych kompleksów białek z kwasami nukleinowymi i badaniach struktury chromatyny.

C. MIKROSKOPIA SKANINGOWO-TUNELOWA

Mikroskopia skaningowo-tunelowa jest precyzyjną techniką charakteryzującą się wysoką rozdzielczością - co najmniej 0,02×0,3 nm, pozwalająca uzyskiwać obraz trójwymiarowy. Za pomocą mikroskopu skaningowo-tunelowego bada się m.in. kompleksy białek z kwasami nukleinowymi oraz topografię DNA.

2. ELEKTROFOREZA

1 Elektroforeza jest obecnie jedna z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania kwasów nukleinowych. W wersji podstawowej jest to prosta i szybka technika używana do rozdzielania cząsteczek DNA, które nie mogą być rozdzielone innymi technikami np. przez wirowanie w gradiencie gęstości.

Do fizycznego opisu elektroforezy służą takie parametry jak: wielkość molekularna DNA - N_D, średnia wielkość porów w żelu - α, natężenie pola elektrycznego - ε;

gdzie M_a jest wielkością fragmentów DNA, które „pasują” do typowej wielkości porów żelu a,
Q_a = M_al_Dλ_D - ładunek cząsteczki o wielkości scharakteryzowanej przez M_a.

A. ELEKTROFOREZA W ŻELU AGAROZOWYM

Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów. Jest to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt heksozy (inaczej - 400 reszt agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem zbudowanym z D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalną, w wyniku której pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową, które rozgałęziają się tworząc sieć. Wielkość porów żelu agarozowego zależy od stężenia agarozy i określa zakres ciężaru makrocząsteczek np. DNA, RNA, które można w niej elektroforetycznie rozdzielać.

Żel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Wadą elektroforezy w żelu agarozowym jest słaba rozdzielczość frakcji DNA różniącego się poniżej 5% wielkości.

Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub TAE×1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8).

Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. DNA o tych samych masach cząsteczkowych, ale różnych konformacjach charakteryzuje różna ruchliwość elektroforetyczna. Im dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłużej odnajduje ona drogę poprzez pory żelu. Jeżeli umieścimy DNA w żelu agarozowym i przyłożymy niskie napięcie to prędkość migracji DNA o różnych ciężarach cząsteczkowych jest proporcjonalna do napięcia. Aby otrzymać optymalny rozdział DNA o wielkości większej niż 2 kp.z, elektroforeza prowadzona jest w polu elektrycznym o natężeniu nie większym niż 5V/cm. Powyżej tego napięcia fragmenty DNA przemieszczają się z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu ich ciężaru cząsteczkowego. Elektroforetyczne zachowanie DNA w żelu agarozowym nie zależy od składu zasad azotowych i słabo zależy od temperatury. Jednak jeżeli stosuje się żele agarozowe o stężeniu mniejszym niż 0,5% należy elektroforezę prowadzić w temperaturze około 4°C.

Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Należy pamiętać, że obecność związku interaklującego do DNA w żelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niż EtBr.

B. ELEKTROFOREZA W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM (PAGE)

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania i analizy małych fragmentów DNA lub białek. Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niż 1000 par zasad. W żelach tych można efektywnie rozdzielać także jednoniciowe fragmenty DNA i RNA.

Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku polimeryzacji N,N'-metylenobisakrylamidu z monomerami akryloamidu w obecności wolnych rodników dostarczonych przesz nadsiarczan amonu i stabilizowanych przez TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina). Stopień usieciowana żelu (udział procentowy N,N'-metylenobisakrylamidu) stanowi czynnik wpływający na rozdzielenie fragmentów jednoniciowego DNA.

Elektroforezę w żelach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a więc migracja cząsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siły ciążenia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzują się spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracja w żelu. Rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1. DNA w żelu poliakrylamidowym można wybarwiać za pomocą np. EtBr lub Sybr Gold.

Żele poliakrylamidowe mają przewagę nad żelami agarozowymi z kilku przyczyn:

- zdolność rozdzielcza żeli poliakrylamidowych jest tak duża, że można rozdzielać cząsteczki DNA różniące się o 1 p.z.

- studzienkę żelu poliakrylamidowego można załadować znacznie większą ilością DNA niż w żelu agarozowym

- DNA odzyskany z żelu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego czyszczenia przy stosowaniu w biologii molekularnej)

C. ELEKTROFOREZA W POLU PULSYJĄCYM (PFGE)

Elektroforeza w polu pulsującym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o bardzo dużej masie cząsteczkowej, np. DNA chromosomalnego wyższych eukariota, którego długość wynosi powyżej 7000 p.z. W metodzie tej zastosowano zmienne, pulsujące, wzajemnie prostopadłe pole elektryczne. Cząsteczki DNA znajdujące się w żelu, do którego zostanie przyłożone takie pole, potrzebuje czasu aby zmienić swoje ułożenie na zgodne z orientacją pola. Czas ten jest tym dłuższy im większa jest masa cząsteczki, a DNA będzie rozdzielana według masy, ponieważ czas trwania impulsu elektrycznego jest krótszy niż czas potrzebny na reorientacje cząsteczki DNA w żelu. Granica rozdzielczości elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym zależy m.in. od stopnia jednorodności stosowanych pól elektrycznych, długości trwania impulsu, względnych wartości natężenia obydwu pól.

D. ELEKTROFOREZA W POLU INWERSYJNYM (FIGE)

Elektroforeza w polu inwersyjnym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o długości 20-2000 p.z., przy czym rozdzielczość tej metody jest około 100-krotnie wyższa niż w przypadku zwykłej elektroforezy agarozowej. Zastosowano tu elektryczne pole inwersyjnym którego wektor natężenia pola zmienia zwrot na przeciwny w określonych momentach. Stosunek czasu trwania impulsu dodatniego do ujemnego wynosi 3:1, a wartości bezwzględne natężenia pola obydwu impulsów są równe. Podczas elektroforezy w polu inwersyjnym łańcuchy DNA ulegają cyklicznym, synchronicznym zmianom konformacyjnym, które trwają do chwili zmiany zwrotu wektora natężenia pola elektrycznego na przeciwny.

E. ELEKTROFOREZA KAPILARNA (CE)

Elektroforeza kapilarna jest stosowana do analizy krótkich, jednoniciowych oligonukleotydów oraz sekwencjonowania DNA. W elektroforezie kapilarnej stosuje się kolumny (kapilary), których wewnętrzna średnica wynosi najczęściej 50-100 μm, natężenie prądu 10-20 μA, a natężenie pola elektrycznego w żelu około 300 V/cm przy zastosowaniu buforu o niskiej przewodności. W tej elektroforezie wykorzystano efekt elektrosomozy. Kapilary wykonane są ze stopionej krzemionki, która zawiera wolne grupy silanolowe ulegające jonizacji pod wpływem działania elektrolitu o pH<2, na skutek czego wewnętrzna powierzchnia kapilar zostaje naładowana ujemnie, a gęstość jej ładunku zależy od pH. Przylegająca warstwa jonów dodatnich z roztworu znajdującego się w kapilarze po przyłożeniu pola elektrycznego porusza się, powodując przepływ cieczy z zewnętrznego zbiornika przez kapilary. Detekcja odbywa się najczęściej przez monitorowanie absorbancji UV na kolumnie. Objętość próbki jest rzędu nanolitrów, co pozwala analizować składniki pojedynczych komórek.

F. ELEKTROFOREZA W ŻELACH DENATURUJĄCYCH (CGGE)

Elektroforeza w żelach denaturujących jest głównie wykorzystywana do wykrywania i analizy mutacji. Wykorzystuje się tu fakt, że temperatura topnienia wiązań wodorowych między zasadami azotowymi DNA zależy od składu zasad komplementarnych nici. Stosuje się tu czynnik denaturujący, głównie mocznika lub formamidu. Elektroforeza prowadzona jest w temperaturze bliskiej temperaturze topnienia danego DNA, zazwyczaj w 55-60°C. Temperatura topnienia DNA zależy od składu ilościowo puryn i pirymidyn w DNA (temperatura topnienia dla G i C jest wyższa niż dla A i T).

3. SPEKTROSKOPIA ABSORPCYJNA

W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stężeń molowych kwasów nukleinowych. Stężenie można otrzymać z pomiaru absorpcji przy długości fali λ = 260 nm (maksymalna absorpcja promieniowania nadfioletowego przez DNA), jeżeli znamy molowy współczynnik ekstynkcji ε:

gdzie l - to długość drogi optycznej w kuwecie. Przyjmuje się, ze wartości współczynnika ekstynkcji wynosi 6600 M^-1cm^-1.

Widmo absorpcji może być wykorzystane do określenia stężenia i czystości próbki DNA. Pomiar stężenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali λ = 260 nm, określanej często jako OD - gęstość optyczna. Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych DNA to bufor o niskim stężeniu jonów, np. bufor TE. Jeżeli A₂₆₀ równa się 1 to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi około 50 μg/ml, jednoniciowego DNA (ssDNA) 36 μg/ml, RNA - 40 μg/ml, a oligonukleotydów 30 μg/ml. Należy jednak pamiętać, że jest to wartość przybliżona, ponieważ wartość współczynnika ekstynkcji zależy od składu zasad azotowych w DNA. Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ jest natomiast często stosowna miarą czystości roztworu DNA, a ściślej miarą zanieczyszczenia DNA białkami (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm). Ogólnie preparat DNA uznaje się za czysty jeżeli A₂₆₀/A₂₈₀ wynosi 1,8-2,0. Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A₂₆₀/A₂₈₀ jest bliższa 2,0, natomiast jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A₂₆₀/A₂₈₀ jest niższa niż 1,8. Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A₂₆₀/A₂₃₀ powinna wynosić 2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm może być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub zanieczyszczeń samej kuwety.

4. MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY

Magnetyczny rezonans jądrowy ma zastosowanie w badaniach struktury Z-DNA, obszarów przejść B→Z-DNA oraz dynamiki tych przejść. NMR stosowany jest także w badaniach nad oddziaływaniem DNA z różnymi ligandami np. w badaniach nad oddziaływaniem m.in. leków przeciwnowotworowych z DNA.

5. SPEKTROSKOPIA PROMIENIOWANIA RENTGENOWSKIEGO

Spektroskopia promieniowania rentgenowskiego stosowana jest w badaniach krystalograficznych struktury DNA, w szczegółową charakterystykę w tym błędnie tworzone pary zasad czy zasady pozahelikalne. Za pomocą tej metody można także badać kompleksy DNA z różnymi związkami jak substancje przeciwnowotworowe i antybiotyki.

6. SPEKTROSOKOPIA RAMANA

Spektroskopia Ramana opisuje rotacyjne i oscylacyjne widma cząsteczek. Pozwala ona na poznanie struktury pojedynczych grup atomów w układach biologicznych, a także pozwala na uzyskanie informacji o szybkich zmianach strukturalnych zachodzących w cząsteczkach biologicznych. W klasycznej metodzie Ramana do wzbudzenia stosowany jest laser argonowy, gdzie DNA można badać w roztworze, w formie odwodnionego włókna lub postaci krystalicznej.

7. SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI

Spektroskopia w podczerwieni była jednym z klasycznych narzędzi w badaniach nad strukturą i oddziaływaniem małych cząsteczek takich jak jony metali czy leki łączące się z DNA poprzez interkalację.

8. SPEKTROSKOPIA FLUORESCENCYJNA

DNA nie wykazuje mierzalnej fluorescencji wewnętrznej z wyjątkiem niskich temperatur. Z DNA wiążą się natomiast znaczniki intekalatorowe jak EtBr czy barwniki akrydynowe, które fluorescencję wykazują. Jednak mają one tę wadę, że wiążą się z DNA niespecyficznie wzdłuż całej długości helisy. W przeciwieństwie do DNA fluorescencję wykazują białka, których fluorescencja w wielu przypadkach nie zmienia się po związaniu z DNA.

9. DICHROIZM KOŁOWY (CD)

Dichroizm kołowy jest zjawiskiem polegającym na zróżnicowanym oddziaływaniu cząsteczek (chiralnych) ze światłem o różnej polaryzacji kołowej. Kwasy nukleinowe ze względu na strukturę helikalną i określoną skręcalność, bardzo dobrze nadają się do badań metodą CD. Metoda ta pozwala różnicować struktury zawierające pętle oraz wykazujące różną skręcalność. Widmo CD zależy od siły jonowej i rodzaju roztworu, w którym się znajduje. Zmiany konformacyjne w kwasach nukleinowych można badać jako funkcje temperatury, pH, rozpuszczalnika. Technika ta jest szeroko stosowana w badaniu przejść konformacyjnych DNA takich jak denaturacja i zmiana form B→A oraz B→A czy rozróżnienie DNA dwuniciowego od trójniciowego. Spektroskopia znajduje także szerokie zastosowanie w badaniu oddziaływań kwasów nukleinowych z substancjami małocząsteczkowymi jak chromofory czy leki. Technika ta znalazła także zastosowanie w badaniu oddziaływań typu: białko-białko czy białko-DNA.

---