Wstęp teoretyczny
Białka to związki wielkocząsteczkowe zbudowane z ponad 100 reszt L-α-aminokwasów połączonych kowalencyjnym wiązaniem peptydowym powstałym z połączenia grupy α-karboksylowej jednego aminokwasu z grupą α-aminową kolejnego aminokwasu.
W organizmie białka pełnią różnorodne funkcje:
Strukturalne – obok wody białko to podstawowy budulec komórek i substancji międzykomórkowej
Regulacyjne – enzymy, niektóre hormony
Receptorowe – receptory błonowe i wewnątrzplazmatyczne odbierające i przekazujące sygnały
Transportujące – np. białka kanałów jonowych w błonie komórkowej czy też białka osocza krwi lub hemoglobina erytrocytów
Obronne – przeciwciała zaangażowane w reakcje immunologiczne
Zapasowe – u roślin w nasionach i organach wegetatywnych
Kolejność poszczególnych aminokwasów w łańcuchu białka czyli tzw. sekwencja aminokwasów określana jest mianem struktury pierwszorzędowej białka. Determinowana jest ona wiązaniami peptydowymi. Struktura pierwszorzędowa jest determinowana genetycznie. Struktura drugorzędowa to pierwotne zwinięcie łańcucha polipeptydowego w przestrzeni. Gdy sposób wzajemnego ułożenia reszt aminokwasów powtarza się regularnie, mamy do czynienia ze strukturami periodycznymi takimi jak α-helisa i β-harmonijka. Strukturę drugorzędową determinują wiązania wodorowe między atomami tworzącymi jednostki peptydowe (pomiędzy grupami i ). Struktura trzeciorzędowa to wtórne zwinięcie łańcucha polipeptydowego. Determinują ją oddziaływania hydrofobowe, siły van der Waalsa, mostki solne (wiązania jonowe) i mostki disiarczkowe oraz wiązania wodorowe. Struktura czwartorzędowa jest to wzajemne ułożenie łańcuchów polipeptydowych w białku oligomerycznym (zbudowanym z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego). Strukturę czwartorzędową stabilizują oddziaływania hydrofobowe i siły van der Waalsa.
Każdy organizm cudzożywny (heterotroficzny) posiada w swoim organizmie enzymy, które rozkładają białka na pojedyncze aminokwasy. Są to enzymy proteolityczne.
Część doświadczalna
Rozpuszczalność i wysalanie
Izolowanie białek roślinnych
Ekstrahowanie albumin i globulin
Wykonanie:
1 g mączki grochowej ekstrahować 25 ml 0,5 M roztworu KCl, w kolbie erlenmeyrce ok. 15 minut, po czym całość odwirować i uzyskaną ciecz nadosadową (supernatant) analizować w następujący sposób:
Wykazać zawartość białka za pomocą reakcji biuretowej: do 2 ml supernantantu dodać 2 ml 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 1% roztworu CuSO4. Próbę wykonać również dla wody i białka jaja kurzego.
Stwierdzić obecność albumin i globulin: do dwu probówek odmierzyć po 1 ml ekstraktu mączki, następnie do jednej dodać 8 ml wody, a do drugiej 8 ml 0,5 M roztworu KCl. Do próby, w której nastąpi zmętnienie dodać parę kropli roztworu KCl.
Obserwacje:
W wyniku reakcji biuretowej próba kontrolna dodatnia przeprowadzona na roztworze białka jaja kurzego zabarwiła się na fioletowo. Próba kontrolna ujemna z wodą zabarwiła się na kolor lekko błękitny. Próba badana (suprenatant) w wyniku reakcji biuretowej uzyskała kolor zbliżony do koloru próby kontrolnej dodatniej (fioletowy).
W probówce z ekstraktem z mączki grochowej i wodą nastąpiło zmętnienie roztworu, które zanikło po dodaniu kilku kropel chlorku potasu. W probówce, w której do ekstraktu z mączki grochowej dodano chlorek potasu roztwór pozostał klarowny.
Wnioski:
Odczyn dodatni reakcji biuretowej dają związki mające co najmniej dwa przylegające do siebie wiązania peptydowe. Dwie przyległe grupy –CO-NH- tworzą wiązanie koordynacyjne z atomem miedzi i wytwarza się kompleks o fioletowej barwie. Reakcja służy do wykrywania białek w roztworze.
Zmiana barwy ekstraktu z mączki oraz białka jaja kurzego w wyniku reakcji biuretowej na kolor fioletowy potwierdza zawartość białka w badanym roztworze.
Wyekstrahowane białko to albuminy i globuliny.
Zmętnienie zaobserwować można było w próbówce z ekstraktem z mączki grochowej i wodą. Świadczy to o tym, że w roztworze obecne były nierozpuszczalne w wodzie białka - globuliny. Białka te do rozpuszczenia wymagają obecności dobrze dysocjującej na jony soli, dlatego po dodaniu do próby roztworu chlorku potasu rozpuściły się, a roztwór stał się klarowny. Globuliny uległy więc procesowi wsalania, czyli zwiększenia rozpuszczalności w wodzie po dodaniu do roztworu soli.
Oczywiście w próbie, w której znajdował się ekstrakt z mączki grochowej i woda obecne były również albuminy, ale iż są to białka rozpuszczalne w wodzie to już na samym początku uległy rozpuszczeniu.
W probówce z ekstraktem z mączki grochowej i chlorkiem potasu nie wystąpiło zmętnienie, gdyż zarówno globuliny, jak albuminy są rozpuszczalne w obecności jonów soli.
Wydzielanie glutenu
Wykonanie:
Z 30 g mąki pszennej i wody przygotować twarde ciasto, odstawić na 15 minut, w celu uwodnienia i spęcznienia białka. Następnie wypłukiwać z ciasta skrobię wygniatając je w strumieniu zimnej, bieżącej wody. Otrzymaną pozostałość o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuścić w 30 ml 0,2M roztworu NaOH i na tak przygotowanym roztworze wykonać reakcję biuretową. Próba kontrola reakcji biuretowej dla wody i dla białka jaja kurzego została wykonana w pierwszym ćwiczeniu.
Obserwacje:
W wyniku reakcji biuretowej badany roztwór zabarwił się na kolor fioletowy.
W wyniku reakcji biuretowej próba kontrolna dodatnia przeprowadzona na roztworze białka jaja kurzego zabarwiła się na fioletowo. Próba kontrolna ujemna z wodą zabarwiła się na kolor lekko błękitny.
Wnioski:
Wykonanie reakcji biuretowej dla badanego roztworu potwierdziło obecność w nim białka, gdyż nastąpiła zmiana barwy roztworu na fioletowy, co świadczy o dodatnim odczynie reakcji. W badanym roztworze znajdowało się wyekstrahowane z ciasta białko - gluten, które ma zdolność rozpuszczania się w rozcieńczonych roztworach zasad.
Wysalanie białek
Wykonanie:
Do 10 ml roztworu białka jaja kurzego dodawać porcjami stały preparat siarczanu amonowego aż do nasycenia roztworu solą. Osad wysolonego białka oddzielić na sączku i rozpuścić bezpośrednio na sączku roztworem 0,5 M KCl. W uzyskanym roztworze sprawdzić obecność białka reakcją biuretową. Do przesączu, otrzymanego po oddzieleniu osadu białka dodać kilka kropli kwasu trójchlorooctowego.
Próba kontrola reakcji biuretowej dla wody i dla białka jaja kurzego została wykonana w pierwszym ćwiczeniu.
Obserwacje:
W wyniku zastosowania metody biuretowej roztwór z rozpuszczonym w chlorku potasu osadem wysolonego białka zmienił kolor na fioletowy. Po dodaniu niewielkiej ilości kwasu trójchlorooctowego do przesączu nie wytrącił się osad.
W wyniku reakcji biuretowej próba kontrolna dodatnia przeprowadzona na roztworze białka jaja kurzego zabarwiła się na fioletowo. Próba kontrolna ujemna z wodą zabarwiła się na kolor lekko błękitny.
Wnioski:
Zmiana barwy roztworu rozpuszczonego osadu na fioletowo - niebieską, po przeprowadzeniu reakcji biuretowej, świadczy o obecności białka w roztworze.
Kwas trójchlorooctowy jest kwasem organicznym, który ma właściwości denaturacji i wytrącania białek z roztworu. Brak osadu w przesączu po dodaniu kwasu trójchlorooctowego świadczy więc o całkowitym wysoleniu białka z roztworu. Gdyby białko było źle wysolone w reakcji z kwasem trójchlorooctowym wydzieliłby się osad.
Białko jaja kurzego to owoalbumina, a więc jest rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli, dlatego osad białka na sączku został rozpuszczony w chlorku potasu.
Wysalanie polega na dehydratacji (likwidacji wodnej otoczki) cząsteczek białka. Wyższe stężenia soli (zależnie od natury samego białka i pH środowiska) powodują wypadanie białek z roztworu. w celu wysalania białek stosuje się sole o dobrym powinowactwie do wody, których jony łatwo tworzą wodziany. Wysalanie jest procesem odwracalnym i nie powoduje zmian rodzimych właściwości białek.
Białka jako koloidy
Wykonanie:
Do dwóch probówek odmierzyć po 1 ml 0,01 M roztworu azotanu srebra, do jednej próby dodać 1 ml roztworu białka jaja kurzego, do drugiej tę samą ilość wody. Po wymieszaniu wprowadzić do każdej probówki 0,01 M roztwór chlorku sodu.
Obserwacje:
Po dodaniu chlorku sodu do obu probówek w próbce z wodą wydzielił się biały osad, natomiast w próbie z białkiem jaja kurzego roztwór pozostał klarowny.
Wnioski:
W probówce zawierającej białko można było zaobserwować działanie ochronne koloidów białkowych. Chlorek srebra to związek hydrofobowy. Białko pełni funkcję stabilizatora i otacza hydrofobowe cząsteczki AgCl narzucając im hydrofilowy charakter.
W probówce z wodą wytrącił się hydrofobowy osad AgCl, co świadczy o braku obecności koloidu hydrofilowego.
Amfoteryczność białek
Strącanie białek za pomocą kationów i anionów
Wykonanie:
Do dziewięciu probówek odmierzyć po 2 ml roztworu białka jaja kurzego odpowiednio o pH równym 8,0; 4,7 i 3,0. Do poszczególnych probówek dodawać kroplami 10% siarczan miedzi, 10% octan ołowiu, 10% wolframian sodu.
Obserwacje:
Po dodaniu siarczanu miedzi osad soli wytrącił się jedynie przy pH= 8,0; po dodaniu octanu ołowiu (II) osad wytrącił się tylko przy pH=8,0 a po dodaniu wolframianu sodowego osad wytrącił się przy pH=3,0. Próby o pH=4,7 pozostały klarowne.
Tabela 1. Zmiany zachodzące w roztworach białka jaja kurzego o danym pH po dodaniu wymienionych roztworów soli.
Odczynnik | 1% roztwór białka jaja kurzego |
---|---|
pH=8,0 | |
10% siarczan miedziowy | + |
10% octan ołowiu (II) | + |
10% wolframian sodowy | - |
Oznaczenia użyte w tabeli:
+ wydzielenie osadu
- brak osadu
Wnioski:
Punkt izoelektryczny białka jaja kurzego (owoalbuminy) występuje przy pH = 4,7.
Osad wytrącony przy pH=8,0 świadczy o tym, że białko przy pH wyższym od punktu izoelektrycznego ma charakter wieloanionowej zasady i łączy się z kationem dodanej do roztworu soli (siarczan miedziowy, octan ołowiu (II)) tworząc białczan miedzi i białczan ołowiu. W badanych próbach powstał osad, ponieważ jony metali ciężkich powodują denaturację chemiczną białka, czyli trwałą destrukcję natywnej konformacji łańcucha makropeptydu, prowadzącą do zmiany fizykochemicznych właściwości białka oraz utraty jej naturalnej biologicznej funkcji.
Osad wytrącony przy pH=3,0 świadczy o tym, że białko przy pH niższym od punktu izoelektrycznego ma charakter wielokationowego kwasu i łączy się z anionem dodanej do roztworu soli (wolframian sodowy) tworząc wolframian białka.
Jony metali ciężkich (miedź, ołów, wolfram) powodują denaturację chemiczną białka, czyli trwałą destrukcję natywnej konformacji łańcucha makropeptydu, prowadzącą do zmiany fizykochemicznych właściwości białka oraz utraty jego naturalnej biologicznej funkcji.
Gdy białko znajdowało się w punkcie izoelektrycznym (pH=4,7) miało postać jonu obojnaczego, a więc miało zrównoważony ładunek w cząsteczce i nie mogło reagować ani z kationami ani z anionami, dlatego w żadnym z przypadków nie wydzielił się osad.
Doświadczenie pokazuje, iż białka w zależności od wartości pH mogą zachowywać się jak kwasy lub jak zasady, a więc mają amfoteryczny charakter.
Denaturacja chemiczna
Wykonanie:
Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml 1% roztworu białka jaja kurzego, po czym dodać po 1 ml odpowiednich roztworów kwasów organicznych (6% kwas sulfosalicylowy, 10% kwas trójchlorooctowy, 5% kwas octowy)
Obserwacje:
Dodatek 6% kwasu sulfosalicylowego oraz 10% kwasu trójchlorooctowego spowodował wytrącenie białego osadu. Dodatek 5% kwasu octowego nie spowodował zmian w próbce, roztwór pozostał klarowny
Tabela 2. Zmiany zachodzące w roztworach białka jaja kurzego po dodaniu wymienionych roztworów kwasów.
KWAS | OBSERWACJE |
---|---|
6 % kwas sulfosalicylowy | + |
10% kwas trójchlorooctowy | + |
5% kwas octowy | - |
Oznaczenia użyte w tabeli:
+ wydzielenie osadu
- brak osadu
Wnioski:
We wszystkich przypadkach w roztworach zaszła denaturacja chemiczna, jednak nie zawsze towarzyszyła jej koagulacja. Jedynie grupa sulfonowa kwasu sulfosalicylowego oraz trzy elektroujemne atomy chloru spowodowały wydzielenie zdenaturowanego białka (kwasy trójchlorooctowy i sulfosalicylowy to odczynniki odbiałczające).
Denaturacja cieplna
Wykonanie:
Do trzech probówek odmierzyć po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH (8,0; 4,7; 3,0). Próby umieścić we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodzić i dodać po 5 ml buforu octanowego do prób zawierających roztwór białka o pH 3,0 i 8,0.
Obserwacje:
W wyniku ogrzewania w próbie o pH=4,7 powstał biały wyraźny osad.
W roztworach o pH 3,0 i 8,0 nastąpiło niewielkie, prawie niezauważalne zmętnienie, które zwiększyło się po dodaniu do tych prób buforu octanowego.
Wnioski:
W wyniku działania wysokiej temperatury we wszystkich probówkach zaszła denaturacja białka. Nie zawsze towarzyszyła jej koagulacja. Bezpośrednio po wyjęciu z łaźni wrzącej wyraźny osad był jedynie w próbie, o wartości pH = pI = 4,7. Zaszła wówczas denaturacja i towarzyszyła jej koagulacja. W próbach o pH 3,0 i 8,0, czyli poniżej i powyżej punktu izoelektrycznego osad był praktycznie niezauważalny. Zaszła wówczas denaturacja, ale nie towarzyszyła jej koagulacja. Dodanie buforu octanowego o pH 4,7 do prób, w których nie było widać wyraźnego osadu spowodowało koagulację białka. Wówczas w tych próbach pH zbliżyło się do wartości punktu izoelektrycznego i zaszła koagulacja. Wynika z tego, że denaturacja jest niezależna od pH, a koagulacja jest zależna od pH.