Badania wstępne: wizualna ocena na podstawie występowania objawów chorobowych: więdnięcia, chlorozy, mozaiki. Zalety: szybka identyfikacja możliwa tylko w przypadku specyficznych objawów. Wady: możliwość popełnienia błędu (podobieństwo objawów), brak możliwości rozróżnienia grup fizjologicznych grzybów, nie uwzględnia zdolności toksykonotwórczych grzybów oraz wrażliwości na fungicydy. Badanie przy użyciu mikroskopu- intensyfikacja patogenu pod mikroskopem w oparciu o cechy morfologiczne charakterystyczne dla danego gatunku. Zalety: metoda tania, wymaga posiadania mikroskopu oraz laboratorium do hodowli grzybów. Wady: szybkość identyfikacji uzależniona od tempa wzrostu grzybni ok. 14dni, wymaga wykwalifikowanego personelu, brak możliwości rozróżnienia grup fizjologicznych grzybów, nie uwzględnia zdolności toksykotwórczych grzybów oraz wrażliwości na fungicydy. Pożywki stosowane w hodowli grzybów: 1.organiczne- stosowane w przypadku większości grzybów. Ich podstawą są produkty roślinne, np. ekstrakty roślinne lub ekstrakt drożdżowy. Mają zmienny skład w zależności od odmiany, stopnia dojrzałości ziarna. Pożywki te ze względu na szeroki skład nie nadają się do badań metabolicznych: *pożywka PDA- (agarowo-ziemniaczana) uniwersalna. *pożywka żytnia- stosowana do hodowli grzybów z rodzaju Phytophthora 2.Półsyntetyczne- składniki pożywek półsyntetycznych są znane prawie w całości tzn. zawierają jeden składnik o nieznanym składzie: pożywka czapka z ekstraktem drożdży-hodowla organiczna grzyboodpornym z rodzaju Pythium. 3.syntetyczne-skład tych podłoży znany jest w całości, stosuje się je do badań metabolicznych: *pożywka SNA- do hodowli grzybów z rodzaju Fusarium. *pożywka czapka- do izolacji grzybów z rodzaju Colleotrichum. *pożywka syntetyczna kwaśna- do izolacji grzybów glebowych. Izolacja DNA z roślin i grzybów strzępkowych: DNA- kwas deoksyrybonukleinowy, nośnik informacji genetycznej występującej w chromosomach. DNA jest polimerem nukleotydów składających się z zasad purynowych (A,G) i pirymidynowych (C,T) oraz cukry deoksyrybozy i reszt kwasu fosforowego. Główne etapy izolacji DNA: *liza komórek- celem pierwszego etapu izolacji DNA jest zniszczenie ścian oraz błon komórkowych. Efektywność tego procesu ma największy wpływ na ilość wyizolowanego DNA. Etap ten zapewnia „uwolnienie” DNA z komórek do buforu ekstrakcyjnego. Najbardziej efektywnym sposobem degradacji ścian komórkowych roślin i grzybów jest ucieranie materiału w ciekłym azocie. W celu degradacji ściany komórkowej stosuje się również enzymy proteolityczne (hydrolizujące białka). Do najczęściej stosowanych należą: *proteinaza K (rośliny, grzyby) *chitynaza (grzyby) *lizozym (bakterie). Detergent (składnik buforu lizującego) wiąże tłuszcze i białka degradując membrany komórkowe. Inaktywacja nukleaz: *nukleazy-enzymy przecinające wiązania fosfodiestrowe w kwasach nukleinowych. *DNA trawiony jest przez DNA-zy, a RNA przez RNA-zy. *dzięki swojej funkcji (niszczenie DNA) spełniają rolę ochronną przed wirusami. *magnez jest faktorem nukleaz. *kofaktory- związki chemiczne, które są potrzebne enzymom do katalizowania konkretnych reakcji chemicznych. *EDTA obecny w buforze lizującym chelatuje jony Mg przez co następuje inaktywacja nukleaz. *drugim sposobem na inaktywację nukleaz jest krótkotrwałe podgrzanie próbki do temp 70-90^oC. Oczyszczanie DNA: *poprzez wytrącanie (precypitację). Metoda ta polega na zastosowaniu w pierwszej kolejności mieszaniny chloroformu/oktanolu (usuwanie białek). W dalszej kolejności następuje wytrącanie (koncentracja) DNA przy użyciu alkoholu (izopropanol, etanol), podczas gdy detergent zostaje usunięty wraz z alkoholem. Oczyszczanie DNA z zastosowaniem mini kolumn- oczyszczanie kwasów nukleinowych polega na wiązaniu DNA na membranach oraz kilkukrotnym przemywaniu membran alkoholem. Ostatni etap polega na elucji DNA z kolumny. Ocena czystości DNA-spektofotometr: A260/280=x, gdzie x<1,5-próba zanieczyszczona białkami; 1,5-1,8-czystość DNA w normie; x>1,8 – zanieczyszczona odczynnikami. Spektrofotometr mierzy DNA przy długości fali 260nm. Pomiar ilości i czystości DNA: Elektroforeza- technika analityczna, której istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym. Diagnostyka PCR, patogenów, GMO i alergenów: Patogen- czynnik chorobotwórczy wywołujący chorobę u danego organizmu (wirusy, bakterie, grzyby). GMO- organizmy zmodyfikowane genetycznie metodą inżynierii genetycznej. Alergen- czynnik wywołujący reakcję alergiczną. Etapy diagnostyki molekularnej: *pobranie materiału do analizy *izolacja DNA *reakcja PCR *elektroforeza produktów PCR (elektroforezy nie przeprowadza się w przypadku analizy Real-time PCR) *sekwencjonowanie DNA (nie przeprowadza się w przypadku stosowania starterów specyficznych gatunkowo). *diagnostyka molekularna polega na identyfikacji czynnika na podstawie sekwencji DNA/RNA. *jest to możliwe dzięki różnicom (polimorfizm) w sekwencji DNA/RNA gatunków. *reakcja łańcuchowa polimerazy jest metodą powielania specyficznych fragmentów DNA In vitro. Komponenty reakcji PCR- amplifikacja fragmentu DNA nastąpi jeśli w probówce w odpowiedniej proporcji znajdują się następujące składniki: *matryca DNA- fragment DNA, który zostanie powielony w reakcji PCR. *startery- dwa krótkie odcinki DNA ok. 20 nukleotydowe których sekwencja jest komplementarna do sekwencji matrycy. Startery: *startery określają wielkość powielonego fragmentu. To od sekwencji nukleotydowej starterów zależy jaki fragment DNA będzie powielony w reakcji PCR. *znaczy to, że w reakcji PCR możemy powielać dowolne fragmenty DNA a to jaki fragment DNA będzie powielony zależeć będzie od sekwencji starterów. 3 etapy reakcji PCR- amplifikacja fragmentu DNA nastąpi jeśli w probówce z odpowiednimi komponentami zapewnimy cykliczne skoki temp w odpowiednim czasie: 1.Denaturacja podwójnej matrycy DNA rozdzielnie podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici, 92^oC. 2.Przyłączanie starterów do matrycy DNA (55-68^oC). 3.synteza nowej nici DNA. Synteza zaczyna się od końców 3’ przyłączonych primerów i jest katalizowana przez polimerazę DNA. Tak więc w wyniku reakcji zostaje powielony fragment DNA zawierający się pomiędzy primerami (72^oC). *reakcja PCR prowadzona jest cyklicznie (30-40 cykli) w termocyklerze gdzie następuje wielokrotne podgrzewanie i oziębianie probówki. *termocykler- urządzenie używane do przeprowadzania reakcji PCR. Jest wyposażone w blok grzejny z otworami na probówki w których przeprowadza się reakcje, urządzenie zapewnia zmiany temp bloku zgodne ze wcześniej zdefiniowanym programem i odpowiednie do efektywnego zajścia PCR. Aby sprawdzić wynik reakcji PCR (czy nastąpiła amplifikacja produktu czy nie) należy przeprowadzić elektroforezę DNA: wynik pozytywny lub negatywny. Diagnostyka PCR patogenów roślin: *w reakcji PCR stosowane są startery specyficzne dla rodzajów (np. Fusarium, Aspergillus) gatunków, ras patogenów. *startery specyficzne zostały opracowane w wyniku badań naukowych, które przedstawiono w publikacjach naukowych. startery uniwersalne: *startery uniwersalne hybrydyzują w reakcji PCR w konserwatywnym (mało zmiennym) obszarze DNA. *sekwencja pomiędzy starterami (produktu PCR) jest zmienna i charakterystyczna (specyficzna) gatunkowo. Sekwencje DNA uzyskujemy w procesie sekwencjonowania produktów reakcji PCR. Sekwencje genów stosowanych w diagnostyce patogenów roślin: *Elongationfactor- 1alpha (EF-1 alpha) koduje białko wchodzące w skład aparatu translacyjnego organizmów eukariotycznych. *Gen beta tubuliny koduje tubulinę- białko globularne wchodzące w skład mikrotubul. *rDNA koduje rybosomalny RNA jest wielokrotnie powtórzony w genomach. Badanie zmienności genetycznej: *DNA fingerpriting, metoda „genetycznych odcisków palców”. Metoda polegająca na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA. *Przedmiotem analiz są jednozarodnikowe izolatygrzybów. PCR-RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism)-organizmy są zróżnicowane poprzez analizy wzorców pochodzących z pojęcia produktów PCR. AFLP (Amplified Fragment LengthPolymorphism. 3 etapy: *strawienie DNA genomowego enzymami restrykcyjnymi i ligacja specyficznych adaptorów do końców fragmentów DNA. *amplifikacja fragmentów DNA z zastosowaniem primerów specyficznych do sekwencji adaptorów i końców fragmentów DNA. *elektroforeza produktów reakcji PCR. Zalety analiz PCR: *wysoka czułość reakcji pg (10^-12) *krótki czas analiz *wiarygodność *bezpieczeństwo dla zdrowia i środowiska. Wady analiz PCR: *nie można ustalić ilości matrycowanego DNA *możliwość wystąpienia wyników fałszywych pozytywnych. Real-time PCR (PCR ilościowy)- w metodzie tej otrzymujemy wynik w postaci ilości matrycy w badanej próbie: *w metodzie stosuje się interkalujące barwniki (SYBR Green) lub hybrydyzujące sondy (np. TaqMan). *reakcja PCR jest związana z emisją sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnego do ilości produktu, który powstaje w każdym cyklu reakcji. SYBR Green- barwnik SYBR Green łączy się z generowanym produktem PCR. Z chwilą rozpoczęcia reakcji PCR wzrasta ilość produktu co powoduje wzrost sygnału fluoroscencyjnego. Wadą metody jest niespecyficzność związana z tym, że barwnik łączy się z każdą dwuniciową cząsteczką DNA będącą składnikiem mieszaniny reakcyjnej. Diagnostyka PCR w praktyce- produkcja roślin: *detekcja patogenów „w polu”. Informacja na temat obecności patogenów w roślinach (wczesny etap infekcji) w połączeniu z wiedzą na temat wrażliwości patogenów na fungicydy umożliwia skuteczną kontrolę patogenów. Różna wrażliwość gatunków na fungicydy, łamliwość podstawy źdźbła, Topesiayallundae (typ w)-gatunek wrażliwy na prochloraz. Topesiaacuformus (typ R)-odporny na prochloraz, ale wrażliwy na cyprodinil. Identyfikacja odporności grzybów na fungicydy/bakterii na antybiotyki: *mutacje DNA są jednym z głównych czynników warunkujących nabycie odporności patogenów na środki chemiczne. *identyfikacja mutacji warunkujących odporność patogenów na fungicydy czy antybiotyki polega na stosowaniu starterów hybrydyzujących w miejscu mutacji w wyniku czego następuje amplifikacja produktów PCR jedynie u form odpornych. Identyfikacja genów warunkujących syntezę mykotoksyn w genomach grzybów toksyno twórczych: Aspergillus, Penicillum, Fusarium.Mykotoksyny- gr. Mykes-grzyb, łactoxicum- trucizna. Rodzaj Aspergillus: *A.flavus i A.parasilicus wytwarzają aflatoksyny powszechnie występujące w produktach żywnościowych i paszach w klimacie umiarkowanym. *A.ochraceus jest głównym źródłem ochra toksyny (OTA) w klimacie subtropikalnym. Zagrożenia: rakotwórczość, embriogenność, mutagenność, osłabienie układu odpornościowego. Rodzaj Penicillum: *w skład tego rodzaju wchodzą 32 gatunki toksyno twórcze wytwarzające 27 rodzajów mykotoksyn. *najważniejszym jest P.verrucosum wytwarzający OTA w klimacie umiarkowanym. Rodzaj Fusarium: *ok. 20 gatunków wywołujący chorobę zwaną fuzariozą kłosów zbóż wytwarzający najbardziej toksyczne mykotoksyny. *do infekcji roślin dochodzi już podczas wegetacji roślin. Trichoteceny: *F.culmarum i F.graminearum wytwarzają DON (deoksyniwalenol)- najczęściej występująca toksyna w ziarnie zbóż na terenie Europy i USA. *NIV (nivakenol), ziarno zbóż. *F.sporotrichioides- toksyna T2 najsilniejsza toksyna, ziarno zbóż. *działanie krwotoczne, dermatotoksyczność, cytotoksyczność, działanie kancerogenne. Fumonizyny: *F.certicillioides- patogen kukurydzy. *zagrożenie neuro-, hepatotoksyczność, rakotwórczość. Mykotoksyny dostają się do organizmu człowieka poprzez: *artykuły spożywcze pochodzenia roślinnego. *artykuły spożywcze pochodzenia zwierzęcego. *bioareozole (wdychanie oraz przez skórę). Wykrywanie genów kodujących mykotoksyny metodą PCR: *jeśli znamy profil toksynotwórczyposzczególnych gatunków grzybów to już diagnostyka co do poziomu gatunku umożliwi oszacowanie potencjalnego zanieczyszczenia produktu mykotoksynami. *jednakże metodą bardziej precyzyjną przewidywania występowania mykotosyn jest stosowanie metody genotypowania (PCR z zastosowaniem starterów komplementarnych do sekwencji genów warunkujących syntezę mykotoksyn). Wykrywanie genów kodujących mykotoksyny metodą PCR: *specyficzność starterów stosowanych w analizach genotypowania genów kodujących mykotoksyny pozwala na aplikację metody z jakiegokolwiek materiału. Geny kodujące syntezę mykotoksyn na podstawie których opracowano metody genotypowania: *tri 5, tri 7, tri 13, tri 3 (DON, NIV). *esyn 1 (enniatyny). *fum1 (fumonizyny). GMO (geneticallymodiffied organizm): *organizm, którego materiał genetyczny został zmodyfikowany metodami inżynierii genetycznej. Transgeniczne rośliny uprawne (GM crops) powstały w wyniku wprowadzenia do genomu gospodarza genu/genów. *na terenie europy produkty spożywcze są znakowane jako genetycznie zmodyfikowane „produced from geneticallymodified [nazwa gatunkowa]” jeśli zawartość GMO w produkcie przekracza 0,9%. Diagnostyka trans genów metodą PCR a wykrywanie protein: *w porównaniu z białkami DNA jest bardziej stabilne w wysokich temperaturach. *metoda PCR jest metodą o większym poziomie czułości (np. test Elisa jest ok. 100x mniej czuły od metody PCR). *transgen jest obecny w każdej komórce gospodarza, a ekspresja genu może dotyczyć wybranych tkanek czy organizmów. Odporność na szkodniki: *kukurydza i bawełna (Bt, B.thuringiensis) są jedynymi obecnie uprawianymi roślinami zawierającymi gen cry (kodujący białko cry) warunkujący odporność roślin na niektóre szkodniki. Odporność na herbicydy: *soja, kukurydza, bawełna, rzepak (Canola) i burak cukrowy. *trans genem jest gen (CP4 EPSPS, Agrobacteriumssp.) warunkujący odporność na glifosat. Diagnostyka alergenów metodą PCR: *alergie pokarmowe stanowią ważny problem zdrowotny w krajach wysoko rozwiniętych. Szacuje się, że problem dotyczy 2% dorosłych i 8% dzieci, a niektóre dane wskazują na to, że 22% populacji cierpi z powodu alergii pokarmowych. *alergen- czynnik wywołujący reakcję układu odpornościowego. *większość alergenów żywnościowych to białka. *ponad 160 składników żywnościowych jest alergennych jednakże 8 powoduje 90% alergii. *diagnostyka PCR alergenów z żywności polega na zastosowaniu w reakcji PCR starterów i sekwencji komplementarnej do sekwencji genów kodujących białka alergenne. *w UE produkty żywnościowe zawierające 12 głównych alergenów są odpowiednio oznakowane (European Food Labelling Directive 2000/13/EC). *dotyczy głównie produktów zawierających seler, gluten, skorupiaki, jaja, ryby, mleko i produkty mleczne, gorczyca, orzechy, orzeszki ziemne, sezam, soja, niektóre konserwy spożywcze. Wskaźniki wymiany gazowej u roślin: Wymiana gazowa u roślin- proces w czasie którego dochodzi do dyfuzji (rozprzestrzenianie się) gazów i ich wymiany między organizmem i jego otoczeniem. W wyniku wymiany gazowej z organizmu jest usuwany tlen i wprowadzany dwutlenek węgla. Dyfuzja gazów odbywa się poprzez aparaty szparkowe, które znajdują się na powierzchni całej rośliny. Znaczenie fotosyntezy: *produkcja pożywienia i materii organicznej (200-220 mld ton)- proces fotosyntezy dostarcza związków organicznych będących źródłem materii i energii dla wszystkich żywych organizmów. Do najważniejszych należą węglowodany i białka. *produkcja tlenu (1 sosna-3 osoby) fotosynteza podtrzymuje w atmosferze stały poziom tlenu, tlen uwalniany w tym procesie a pochodzący z wody jest niezbędny do oddychania dla większości organizmów. Bez fotosyntezy znaczna cześć tlenu byłaby zablokowana w wodzie. *redukcja CO₂ (1 ha lasu asymiluje 150-200 ton CO₂). W procesie fotosyntezy zostaje rozkładany dwutlenek węgla tworzący się podczas oddychania i spalania. Gdyby nie fotosynteza stężenie CO₂ stale by wzrastało. Zatem fotosynteza to: *pokarm dla ludzi i pasza dla zwierząt. *drewno i opał (węgiel, ropa, gaz). *włókno roślinne (do produkcji lin, ubrań). *kauczuk i gutaperka. *barwniki roślinne. *miód. *lekarstwa, używki, barwniki i wiele innych. Fotosynteza(definicja)- to synteza związków organicznych z prostych substancji nieorganicznych przy udziale energii świetlnej. Faza jasna- przekształcenie energii zawartej w świetle na energię wiązań chemicznych dwóch wysokoenergetycznych związków chemicznych: ATP (Adenozynotrifosforan) i NADPH (di nukleotyd nikotynoamidoadeninowego). Następuje oderwanie elektronu od cząsteczki wody i przeniesienie go za pomocą kompleksów białkowych (PsI, PsII, kompleks cytochromowy b6f, plastochinonplastocjaniny) na utlenioną formę NADP. Zachodzi w tylakoidach chloroplastów. Faza ciemna- cykl Calvina-Bensona. Polega na wykorzystaniu zgromadzonych w ATP i NADPH energii do związania i wytwarzania prostych cukrów (asymilatów). Zachodzi w stromie chloroplastów. Faza karboksylacyjna- rozpoczyna się od przyłączenia cząsteczki CO₂ do 1,5-bifosforybulozy (RuBP). Reakcja ta katalizowana jest przez enzym o nazwie karboksylaza oksygenza 1,5-bifosforybulozy często określanym jako enzym RuBisCO lub karboksydysmutaza. W wyniku przyłączenia CO₂ powstaje nietrwały produkt przejściowy 1,5-bisfosfo-2-karboksy-3-ketoarabinitol, który szybko ulega rozpadowi na dwie cząsteczki kwasu 3-fosfoglicerynowego (PGA). Faza regeneracyjna- w tej fazie z aldehydu 3-fosfolglicerynowego i jego izomeru fosfodihydroksyacetonu odtwarzana jest w wyniku wielu reakcji chemicznych 1,5-bisfosforybuloza. Część aldehydu 3-fosfoglicerynowego, która nie jest potrzebna do odtwarzania akceptora CO₂ jest przekształcana w glukozę, a w dalszych etapach w skrobię (synteza). W cyklu Calvina-Bensona zużywane są wytworzone w fazie jasnej ATP i NADPH, a ich energia przekazywana i magazynowana jest w postaci wiązań wytworzonych w cyklu cukrów. Wyróżniamy 3 etapy fotosyntezy: *C3 (ponad 95% wszystkich roślin) produktem powstałym w wyniku karboksylacji (związanie CO₂ z RuBP) jest PGA (fosfoglicerynian) związek 3 weglowy(C3). *C4 (ok. 1% roślin) produktem powstałym w wyniku karboksylacji (związanie CO₂ z PEP fosfoenolopirogronianem) jest OAA (szczawiooctan) związek 4 węglowy (C4). Przebieg fotosyntezy C3 i C4 różni się zasadniczo. Efekt Warburga- wydaje się, że typ fotosyntezy C4 jest młodszy ewolucyjnie i lepiej dostosowany do trudniejszych warunków środowiska, dlatego też rośliny charakteryzujące się tym rodzajem fotosyntezy są mnie wrażliwe na stresy wynikające z okresowych niedoborów wody. Wynika to chociażby z tego, że w nocy zawartość kwasów organicznych i kwasowość komórek wzrasta, natomiast zawartość cukrów maleje, gdyż odprowadzone są do organów akceptorowych. W ciągu dnia natomiast zmniejsza się poziom kwasów, a zawartość cukrów powstających w reakcji fotosyntezy wzrasta. Takie dobowe zmiany natężenia metabolitów komórkowych są przykładem adaptacji roślin do środowiska ubogiego w wodę. Również optimum fotosyntezy u roślin typu C4 kształtuje się w granicach 35^oC w porównaniu do optymalnej temp wynoszącej 25^oC dla roślin typu C3 wydaje się wskazywać na lepsze dostosowanie się pierwszej grupy roślin ocieplającego się klimatu. Jednak kukurydza wschodząca w warunkach niskiej temp wykazuje zahamowanie pobierania związków fosforu z gleby, co jawi się charakterystycznymi przebarwieniami liści i spadkiem intensywności fotosyntezy ze względu na niedostatek związków energetycznych ATP oraz zamykanie aparatów szparkowych oraz ograniczonego wiązania CO₂ w wyniku spadku aktywności karboksylazy RuBP. Proces fotosyntezy choć determinowany jest genetycznie ulega modyfikacjom po wpływem czynników środowiska. Skala zmian zależy jednak nie tylko od wystąpienia bodźca, ale również od jego natężenia. Na szybkość fotosyntezy roślin wpływa wiele zewnętrznych i wewnętrznych czynników. Czynniki wewnętrzne: *struktura liścia *zawartość chlorofilu *nagromadzenie w chloroplaście asymilatów *wpływ enzymów *zaopatrzenie w składniki mineralne. Zewnętrzne czynniki to: *abiotyczne: rodzaj i natężenie światła; temperatura; stężenie CO₂ i O₂; dostępność wody *biotyczne: porażenie przez szkodniki; choroby; zagęszczenie roślin (konkurencja wewnątrz- i międzygatunkowa). Czynniki abiotyczne: Rodzaj i natężenie światła Światło to promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 380-780nm, które jest częścią całkowitego promieniowania słonecznego. Rośliny w procesie fotosyntezywykorzystują jedynie część spektrum promieniowania słonecznego w zakresie długości fali 400-700nm, który w fizjologii roślin nazywany jest promieniowaniem fotosyntetycznie czynnym (PAR) stanowi ono przeciętnie ok.45% całkowitego promieniowania słonecznego. Zarówno ultrafiolet (poniżej 380nm) jak i podczerwień (powyżej 780nm) nie są wykorzystane w procesie fotosyntezy, ale wpływają na procesy morfogenetyczne roślin. Nadmiar PAR rośliny wrażliwe na nadmiar światła należą do ciepłolubnych, a wzrost radiacji PAR do poziomu ok. 1800µE m^-2s^-1 jest przyczyną uszkodzeń PSII, powstają wolne rodniki które uszkadzają struktury komórkowe, prowadzą do uszkodzeń DNA, blokują aktywność enzymatyczna. Jednak rośliny potrafią się bronić przez intensywne fotooddychanie, a CO₂ jest powtórnie reasymilowany przywracając równowagę między faza świetlną i ciemniową- ponadto przed fotoinhibicją rośliny bronią się wytwarzając karotenoidy np. zeaksantyna Zakres promieniowaniaultrafioletowego : ultrafiolet-C : 100-280nm; ultrafiolet-B: 28-315nm; ultrafiolet-A: 315-380nm. Temperatura: C3: 25-28⁰C; C4: 32-35⁰C; 0-10⁰C chłód; poniżej 0⁰C mróz. Przemarzanie powoduje zwiększenie stężenia wolnych cukrów w cytoplazmie. Zdolność do fotosyntezy w niskiej temp. jest związana ze wzrostem aktywności enzymów cyklu Calvina (Rubisco; 1,6-frukto bifosfataza w stromach chloroplastów)oraz enzymów szlaku biosyntezy sacharozy . stężenie CO₂ i O₂. Dla roślin 100 krotny wzrost zawartości CO₂ stanowiłby optymalne stężenie w procesie fotosyntezy. Istotnym elementem wpływającym na wydajność roślin uprawianych w warunkach szklarniowych jest nawożenie CO₂ w szklarniach co pozwala nie tylko zwiększyć plon o kilkanaście do kilkudziesięciu procent ale również przyśpiesza wzrost oraz zwiększa liczbę liści i kwiatów. Podwyższony poziom dwutlenku węgla w szklarni sprzyja też regeneracji roślin namnażanych drogą kultur tkankowych w niektórych przypadkach pozwala też obniżyć koszty związane z doświetleniem zimą. Rośliny szybko aklimatyzują się do podwyższonego stężenia dwutlenku węgla w efekcie czego ich fotosynteza obniża się do poziomu kontroli lub nawet niżej. Dzieje się tak m.in. w związku z zamykaniem aparatów. Rośliny rosnące w warunkach podwyższonego stężenia CO₂ wykazują zmniejszenie przewodności szparek. Reakcja ta pozwala roślinie prowadzić oszczędniejszą gospodarkę wodną przy takim samym natężeniu fotosyntezy. Przy zmniejszonej przewodności szparek ograniczona jest transpiracja, a dostępność CO₂ do komórek mezofilu pozostaje niezmieniona ze względu na jego wyższe stężenie na zewnątrz. Kolejnym efektem jest gromadzenie się cukrów niestrukturalnych liściach. Dostępność wody. Ponad 97% to woda słona, słodka stanowi 3% z tego: rolnictwo wykorzystuje 69% , przemysł 23% światowego zużycia słodkiej wody, gospodarstwa domowe jedynie 8%. W ubiegłym wieku zużycie na cele rolnictwa wzrosło sześciokrotnie. Zawartość wody w roślinach 70-95%, w nasionach 10-15%. Funkcja wody w roślinie: w komórkach jest rozpuszczalnikiem substancji biologicznie czynnych (aktywnych), stanowi środowisko reakcji chemicznych. Bierze udział w tych reakcjach jako substrat np. donor wodoru w reakcji fotosyntezy lub produkt reakcji- końcowy produkt oddychania. Woda molekularna związana z makromolekułami odpowiada za ich strukturę (białek, kwasów nukleinowych, lipidów błon). Wypełniając wakuolę podtrzymuje turgor całej rośliny. Umożliwia szybki wzrost elongacyjnykomórek i tkanek. Bierze udział w transporcie związków mineralnych, wtórnych metabolitów, produktów asymilacji w roślinie, transport apoplastyczny (w obrębie ścian komórkowych) oraz symplastyczny (poprzez cytoplazmę między komórkami- akwoporyny). W warunkach dużego nasłonecznienia i wysokiej temp. intensywna transpiracja pozwala obniżyć temp. Współczynnik transpiracji- ilość wody potrzebna roślinie w okresie wegetacji do wyprodukowania 1kg s.m. zboża-500-650; motylkowate- 700-800; ziemniaki i buraki- 400-650; kukurydza- 270-320. Czynniki biotyczne:* Choroby . W zaawansowanym stadium choroby intensywność fotosyntezy może być zredukowana nawet o 75%. Obniżenie tego procesu jest efektem m.in. ograniczenia powierzchni asymilacyjnej na skutek zniszczenia zielonych organów roślin, zahamowania ich wzrostu lub występowania rozległych nekrotycznych plam. Ponadto w porażonych roślinach w wyniku zniszczenia organelli komórkowych zostaje zakłócona gospodarka wodna, oddychanie oraz fotosynteza. Jednak ograniczenie intensywności fotosyntezy może wystąpić dopiero w czasie rozpoczęcia drugiej fazy patogezezy wyrażającej się więdnięciem liści, a nie fazie inkubacji spadek ten znacznie się wzmaga w trzeciej fazie rozwoju patogenezy tj. w czasie tworzenia się nekroz. *porażenie przez szkodniki, zwierzęta, gryzonie, deptanie *zagęszczenie roślin (konkurencja wewnątrz- i międzygatunkowa) *antropogeniczne (zanieczyszczenia przemysłowe, środki ochrony roślin, ubicie gleby, pożary, pole elektromagnetyczne). Test Elisa jest metodą immunologiczną służącą do wykrywania określonych białek (antygenów), w której obecność i stężenie antygenu ocenia się dzięki reakcji barwnej z przeciwciałem. Przeciwciała IgG- immunoglobuliny *są to rozpuszczalne białka syntetyzowane przez organizm w odpowiedzi na pojawienie się obcych substancji *każde przeciwciało ma swoiste powinowactwo do obcego materiału, który stymuluję jego syntezę Antygen *białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe *obca cząsteczka w organizmie zdolna do syntezy przeciwciał *struktura antygenu musi być wystarczająco unikatowa, aby możliwe było rozpoznanie go przez układ odpornościowy. Komórki układuodpornościowego: limfocyt- kom. układu odpornościowego należąca do leukocytów zdolna do swoistego rozpoznania antygenów limfocyty B-powstają w czerwonym szpiku kostnym, pełnią funkcję w odpowiedzi odpornościowej humoralnej limfocyty T- odpowiedzialne za odpowiedź komórkową tzn. niszczą komórki obce dla organizmu. Budowa IgG zbudowane z dwóch łańcuchów lekkich i dwóch łańcuchów ciężkich rejonu zawiasowego. Fab- miejsca wiązania antygenu; Fc- jednostka pośrednicząca w funkcjach efektorowych. Rola IgG-IgG stanowią aż 80% immunoglobulin w surowicy. Istnieją 4 klasy: IgG-IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, kodowane przez różne geny C_H których sekwencja DNA jest w 90-95%homologiczna. IgG1, IgG3 i IgG4-przenikają przez łożysko i pełnią główną role ochronną dla rozwijającego się płodu. Pełnią główną role w ochronie rejonu naczyniowego przed drobnoustrojami i ich toksynami. Struktura przestrzenna IgE- IgE pośredniczą w natychmiastowej reakcji nadwrażliwości i odpowiedzialne są za występowanie alergicznych symptomów: kataru siennego, astmy, pokrzywki i szoku anafilaktycznego. Biorą także udział jako mediatory w obronie organizmu przed pasożytami. Struktura przestrzenna IgA-IgA jest dominującą klasą immunoglobulin w zewnętrznych wydzielinach: mleku matki, ślinie, łzach i śluzie oskrzelowym. Epitop- miejsce wiązania przeciwciał z antygenem. Test Elisa warunki konieczne do spełnienia: *przeciwciało IgG swoiste dla danego białka *obecność w próbie antygenu (obcego) *koniugat- przeciwciało znakowane enzymem-alkaliczną fosfatazą *substrat-P-nitrofenylofosfat związek bezbarwny, który w reakcji z alkaliczna fosfatazą powoduje powstawanie reakcji barwnej. Test Elisa wykorzystywany jest w diagnostyce: *chorób człowieka, zwierząt i roślin powodowanych przez wirusy, bakterie, mikoplazmy i grzyby *toksyn grzybowych w materiale roślinnym: aflatoksyny B1, B2, G1, G2, M1,DON-u, fumonizyny, ochratoksyny A, toksyny T-2. Typy wirusów *wirus typu A zakaża ludzi oraz inne ssaki, a także ptaki. Najczęściej wywołuje epidemie i pandemie. Wirus typu A zawiera białka H1N1, H2N2, H3N3.