Łańcuchowa reakcja polimeryzacji

PCR - łańcuchowa reakcja polimeryzacji to metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.

PCR używana do amplifikacji sekwencji DNA odbywa się z użyciem pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA. Startery te są wydłużane w kierunku do siebie, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA, w cyklu reakcji obejmującym trzy etapy:

• denaturację,

• przyłączenie startera

• polimeryzację.

Jeśli przygotowujemy dwa oligonukleotydowe startery to w kolejnych cyklach denaturacji, przyłączania startera i polimeryzacji można znacznie zamplifikować poszczególne rejony matrycy DNA. Wielkość tych rejonów określają miejsca wiązania się starterów, pod warunkiem, że zaprojektowana para oligonukleotydowych starterów jest komplementarna do docelowej cząsteczki DNA i może być wydłużana przez polimerazę DNA w kierunku do siebie. Cały ten proces znany jest jako łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR).

Odkrycie termostabilnej polimerazy DNA spowodowało, że poszczególne etapy w cyklu PCR można przeprowadzić w bardzo łatwy sposób. Metoda PCR znalazła zastosowanie w wielu dziedzinach nauki i znajduje wiele zastosowań, m.in. :

• w badaniach nad genomem,

• charakterystyce ekspresji genów,

• klonowaniu i analizie genów,

• diagnostyce klinicznej,

• identyfikacji osób zaginionych,

• kryminalistyce,

• paleontologii.

CYKLE PCR

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach.

Cykl reakcji obejmuje etap:

• denaturacji dwuniciowego DNA w 95^oC,

w pierwszym cyklu docelowe cząsteczki DNA rozdzielane są na 2 nici, w wyniku ogrzewania mieszaniny do 95°C, zazwyczaj przez około 60 sekund

• etap przyłączenia startera w temp. około 55°C

w celu przyłączenia starterów, obniża się temperaturę do około 55°C (przez około 30 sekund). Aktualna temperatura przyłączenia starterów zależy od długości startera i jego sekwencji.

• etap polimeryzacji w 72°C

po przyłączeniu starterów podnosi się temperaturę mieszaniny do 72°C (przez 60-90 sekund), w której zachodzi optymalna polimeryzacja z wykorzystaniem dNTP i Mg²⁺ zawartych w mieszaninie reakcyjnej

Wymagana jest: matryca, startery, bufory, enzym, Mg²⁺ i dNTP.

Reakcję przeprowadza się przez zmieszanie ze sobą cząs­teczki DNA stanowiącej matrycę, która może być obecna w bardzo niewielkich ilościach, oraz nukleotydów, dwóch syntetycznych oligonukleotydowych starterów i termostabilnej polimerazy DNA.

W pierwszym etapie polimeryzacji każda nić docelowego DNA jest kopiowana od miejsca przyłączenia startera na różną długość, co trwa aż do rozpoczęcia drugiego cyklu, w którym mieszanina reakcyjna jest ponownie ogrzewana do 95°C, by denaturować nowo powstałe cząsteczki DNA.

W kolejnym etapie drugi starter może wiązać się do powstałej nowej nici DNA i podczas polimeryzacji kopiować tę nić aż do miejsca, w którym znajdował się początek pierwszego startera. W ten sposób w końcowym etapie drugiego cyklu występują już cząsteczki nowo syntetyzowane o właściwej długości. W następnych cyklach szybko zwiększa się (w każdym cyklu dwukrotnie) liczba cząsteczek o właściwej długości.

Jeśli reakcja PCR zachodzi z wydajnością 100%, jedna docelowa cząsteczka po n cyklach ulega amplifikacji z krotnością równą 2ⁿ. W praktyce powszechnie stosuje się 20-40 cykli, nim enzym ulegnie ostatecznej inaktywacji albo startery lub nukleotydy zostaną zużyte.

MATRYCA

Metodą PCR z udziałem zaprojektowanych starterów można amplifikować prawie każdy DNA, jeśli zawiera on co najmniej jedną nieuszkodzoną docelową cząsteczkę DNA.

Podczas reakcji PCR uzyskuje się ogromne zwielokrotnienie wyjściowej ilości DNA; można czasami amplifikować nawet pojedynczą cząsteczkę wyjściowej matrycy. Dlatego też każde źródło, które dostarcza jednej lub więcej docelowych cząsteczek DNA, może być w zasadzie wykorzystane jako źródło matryc dla PCR.

Dotyczy to DNA izolowanego z:

• krwi,

• plemników,

• każdej innej tkanki,

• z archiwalnych materiałów stanowiących dowód w sądownictwie,

• z dawnych prób biologicznych,

• w laboratoriach — z kolonii bakteryjnych albo łysinek fagowych,

• z oczyszczonego DNA.

Jakie by jednak nie było źródło matrycowego DNA, PCR można stosować jedynie wtedy, gdy znamy sekwencje oskrzydlające powielany odcinek DNA, by można było zaprojektować komplementarne do nich startery.

STARTERY

Para oligonukleotydów powinna mieć długość około 18-30 nukleotydów i wykazywać podobną zawartości G+C. Będzie ona spełniać rolę starterów PCR tak długo, jak długo kierują one syntezą w kierunku jeden do drugiego. Jeśli sekwencja docelowego DNA jest całkowicie nieznana, można stosować startery w pewnym stopniu zdegenerowane.

Startery powinny łączyć się z sekwencjami komplementarnymi w podobnych temperaturach. Dla krótkich oligonukleotydów (krótszych niż 25 nukleotydów) temperatura (w ^oC) może zostać obliczona według wzoru: Tm=2 (A+T)+ 4 (G+C).

Startery są tak projektowane, by mogły się przyłączyć do przeciwległych nici sekwencji docelowej, i dlatego w wyniku dodawania nukleotydów do ich końca 3', z udziałem polimerazy, są wydłużane w kierunku jeden do drugiego. Krótkie docelowe sekwencje amplifikują się łatwiej i dystans pomiędzy starterami jest często mniejszy niż 500 pz, ale w optymalnych warunkach za pomocą PCR można zamplifikować również fragmenty o długości ponad 10 kpz.

Jeśli sekwencja DNA, która ma być amplifikowana, jest znana, zaprojektowanie starterów jest stosunkowo proste. Na końcach rejonu, który ma być amplifikowany (na przykład w celu wyszukania mutacji w pewnych onkogenach), należy znaleźć dwie sekwencje o długości około 20 nukleotydów z podobną zawartością G+C. Jeśli produkt PCR ma być klonowany, rozsądne jest takie zaprojektowanie starterów, by w pobliżu końców 5' zawierały one unikatowe miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.

Jeśli sekwencja docelowego DNA nie jest znana, na przykład przy próbie klonowania cDNA białka, którego znana jest tylko krótka sekwencja aminokwasowa, to zaplanowanie starterów jest trudniejsze. W takich przypadkach, stosując reguły kodu genetycznego, konstruuje się zdegenerowane startery, które zawierają wszystkie możliwe sekwencje DNA zdolne do kodowania poznanej sekwencji aminokwasów.

Na przykład: His-Phe-Pro-Phe-Met-Lys są kodowane przez sekwencje DNA: 5'-CAYTTYCCNTl YATGAAR-3', gdzie Y=pirymidyna, R=puryna i W=jakakolwiek zasada. Ta sekwencja jest 2x2x4x2x2 = 64- -krotnie zdegenerowana. Jeśli zatem przygotuje się mieszaninę wszystkich 64 sekwencji i zastosuje jako starter, to jedna z tych sekwencji będzie prawidłowa. Drugi starter musi być przygotowany w podobny sposób. Gdy jedna ze znanych sekwencji peptydu jest sekwencją N-końcową, znana jest też orientacja tej sekwencji i można określić kierunek przyłączenia starterów.

Reakcja PCR, w której stosuje się zdegenerowane startery oligonukleotydowe, jest czasami nazywana DOP-PCR.

ENZYMY

Do reakcji PCR stosuje się termostabilne polimerazy DNA (na przykład Taq polimerazę), ponieważ nie ulegają one zniszczeniu podczas etapu denaturacji DNA w wysokiej temperaturze. Polimerazy te są wyizolowane z wielu termofilnych bakterii, a ich geny sklonowane. Niektóre z polimeraz dość często popełniają błędy, inne nie.

Najbardziej popularna jest Taq polimeraza z Thermus aquaticus. Wytrzymuje ona etap denaturacji 95°C przez 1-2 min i w tej temperaturze ma okres półtrwania wynoszący ponad 2 godziny. Wiadomo, że polimeraza Taq podczas kopiowania DNA wprowadza błędy — przeważnie 1 błąd na 250 polimeryzowanych nukleotydów — ponieważ nie posiada aktywności naprawczej egzonukleazy 3'->5'. W związku z tym do pewnych celów stosuje się inne termostabilne polimerazy DNA, działające z większą dokładnością.

OPTYMALIZACJA PCR

Optymalizacja PCR nie przebiega zwykle ze 100% wydajnością nawet kiedy stosuje się klonowany DNA i startery o określonej sekwencji. W celu zwiększenia wydajności należy zwykle odpowiednio zmienić warunki reakcji.

W celu wiernej amplifikacji DNA może okazać się konieczne dostosowanie temperatury przyłączenia starterów lub stężenia Mg²⁺ do wymogów konkretnej próbki. W przypadku złożonych mieszanin, specyficzność amplifikacji można polepszyć stosując inną parę starterów.

Jest to bardzo ważne w przypadku kiedy próbuje się amplifikować docelową sekwencję występującą w populacji z innymi sekwencjami, na przykład jeden gen z genomowego DNA lub jeden cDN A albo z biblioteki cDNA, albo też z produktów reakcji syntezy pierwszej nici cDNA. Tę ostatnią metodę, w której mDNA ulega odwrotnej transkrypcji do cDNA i następnie pierwsza nić cDNA poddana zostaje amplifikacji za pomocą PCR, nazywa się RT-PCR (ang. reverse transcriptase — PCR).

Jeśli przebieg reakcji nie jest optymalny, to podczas badania produktów, często zamiast zdefiniowanego prążka w żelu pojawia się raczej rozciągnięta plama mieszaniny rozmaitych produktów.

W reakcji PCR zmianom poddaje się zwykle parametry dotyczące temperatury przyłączania starterów i stężenia Mg2+. Zbyt niska temperatura przyłączenia powoduje faworyzowanie niewłaściwego łączenia nukleotydów w pary. W przypadku amplifikacji każdej nowej sekwencji zmienia się optymalne stężenie Mg²⁺, chociaż zwykle mieści się ono w granicach 1- 4 mM. Specyficzność reakcji można poprawić przez zastosowanie zlokalizowanego PCR, podczas którego w drugiej rundzie PCR stosuje się nowy zestaw starterów, które przyłączają się do wewnętrznych miejsc fragmentu amplifikowanego przez pierwszą parę starterów, co prowadzi do otrzymania krótszego produktu PCR.

Jeśli podczas pierwszej rundy PCR powstają pewne niespecyficzne produkty, co daje rozciągniętą plamę lub dużą liczbę prążków, zastosowanie zlokalizowanego PCR powinno zapewnić amplifikację z tej mieszaniny tylko pożądanego produktu, gdyż tylko ta sekwencja jest jedyną, która zawiera obydwa rodzaje miejsc wiążących startery.

ODMIANY PCR

Odmiany podstawowej reakcji PCR to:

• ilościowy PCR,

• PCR z użyciem zdegenerowanych starterów (DOP-PCR),

• odwrotny PCR,

• multipleks PCR,

• szybka amplifikacja końców cDNA (RACE),

• mutageneza z zastosowaniem PCR.

Jeśli do reakcji PCR doda się kilka różnych par starterów, to można amplifikować więcej niż jeden fragment DNA w tej samej reakcji. Fragmenty te można następnie łatwo rozdzielić na żelu, jeśli są różnej długości. Zastosowanie kilku zestawów starterów w reakcji jest nazywane multipleks PCR i jest często wykorzystywane jako szybki test do wykrycia obecności mikroorganizmów, mogących zanieczyszczać pożywienie, wodę lub infekować tkanki.

Modyfikacje podstawowej reakcji PCR dają możliwość amplifikowania (i stąd klonowania) sekwencji, które leżą powyżej i poniżej rejonu amplifikowanego, przy pomocy podstawowej pary starterów. Na przykład, jeśli genomowy DNA jest najpierw wytrawiony enzymami restrykcyjnymi, a fragmenty DNA są następnie ligowane do formy kolistej, można zastosować startery o odwrotnej orientacji do tych, które amplifikowały znany fragment. Otrzymamy w ten sposób amplifikację fragmentów oskrzydlających z obu stron znany odcinek DNA.

Ta reakcja jest znana jako odwrotny PCR .

Załóżmy, że powieliliśmy odcinek mRNA, stosując technikę RT-PCR. Uzyskaliśmy w ten sposób fragment cDNA. Możemy następnie zastosować technikę, która umożliwi zamplifikowanie rejonu oskrzydlającego od końca 5' wyjściowy mRNA. W tym celu przyłączamy do pierwszej nici cDNA ogon oligonukleotydowy (np. oligo(dC)) wykorzystując enzym zwany terminalną transferazą. Pozwala to zastosować parę starterów do reakcji PCR: starter specyficzny dla genu i starter oligo(dG). Technika ta jest nazywana szybką amplifikacją końców cDNA (RACE). Sekwencja oskrzydlająca eukariotyczny mRNA od końca 3' jest amplifikowana techniką y RACE za pomocą startera specyficznego dla genu i startera oligo(dT), który będzie hybrydyzował z ogonem poliA występującym na końcu 3' mRNA. PCR może także być użyty do przygotowania znakowanych sond stosowanych do przeszukiwania bibliotek lub potrzebnych w metodzie Southerna . Sondy takie uzyskuje się dodając odpowiednie radioaktywne lub zmodyfikowane nukleotydy w późniejszych etapach reakcji PCR, lub znakując otrzymane produkty PCR. Technikę PCR można także stosować do wprowadzenia specyficznych mutacji do danego fragmentu DNA.

Za pomocą ilościowego PCR można określić ilość (liczbę cząsteczek) DNA w próbie badanej. Jedną z najlepszych metod stosowanych w ilościowym PCR jest dodanie do badanej próbki przed amplifikacją znanej ilości podobnego fragmentu DNA, który zawiera krótką delecję. Stosunek ilościowy dwóch powstających produktów zależy od ilości dodanego fragmentu z delecją i pozwala wyliczyć ilość docelowej cząsteczki w badanej próbie. W asymetrycznym PCR amplifikuje się tylko jedną nić (w sposób liniowy). Technika ta ma zastosowanie w sekwencjonowaniu DNA i jest znana jako cykliczne sekwencjonowanie. PCR może być także stosowany do zwiększenia czułości metody odcisku DNA .