TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

1. czym jest PCR (etapy PCR i ich kolejność, czym kierować się podczas wybierania temperatur i czasów dla każdego z etapów)

2. co to insert

3. przypomnieć sobie dyskusje na temat zadania 9 z listy 2 z BM

4. cDNA

5. składy roztworów czyli co po co :) wymagania stężeniowe poszczególnych składników mieszaniny

6. polimerazy i ich aktywności

7. projektowanie starterów, na co zwrócić uwagę, czego unikaćz

8. potrzebna będzie mapa wektora pGEX-2T z pierwszych zajęć

9. wiedzieć co to jest ORF

1. PCR - Polymerase Chain Reaction, Reakcja Łańcuchowa Polimerazy. Metoda służąca do powielania łańcuchów DNA, polega na wielokrotnym podgrzewaniu i oziębianiu próbki.

Etapy:

1. Denaturacja wstępna-kluczowe jest, aby matryca DNA była całkowicie zdenaturowana na początku reakcji, żeby mieć pewność, że od pierwszego cyklu następuje PCR.

2. Denaturacja - rozplecenie podwójnej helisy matrycy DNA. Temperatura ok. 95C, 15 s (pękają wiązania wodorowe, podwójna helisa rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy).

3. Annealing- hybrydyzacja starterów z nićmi DNA. Gwałtowne chłodzenie do 50-60C. Starter tylny (wsteczny) hybrydyzuje z nicią kodującą, ale zawiera sekwencję nici matrycowej. Starter przedni hybrydyzuje z nicią matrycową, ale posiada sekwencję nici kodującej. Jeżeli powstają niespecyficzne produkty, temperatura hybrydyzacji powinna być zoptymalizowane (stopniowe (1-2C) podwyższanie). Jeżeli temperatura jest za wysoka startery słabo parują z matrycą i wydajność PCR jest słaba. Jeżeli temperatura jest zbyt niska startery parują niespecyficznie i otrzymujemy niechciane fragmenty DNA.

4. Synteza DNA (elongacja) - ogrzewanie do 72C (temperatura optymalna dla polimerazy DNA Taq). Polimeraza wydłuża sekwencje od starterów w kierunku sekwencji docelowej, ponieważ synteza DNA przebiega w kierunku 5’->3’.

5. Dokończenie polimeryzacji-żeby polimeraza mogła dokończyć wszystkie niedokończone produkty.

2. Insert - fragment kwasu nukleinowego wstawiony do genu lub chromosomu.

3. Zadanie 9. z listy drugiej-seminarium biologia molekularna

You have been supplied with the linker oligonucleotide d(GGAATTCC) and an isolated and purified DNA restriction fragment that has been excised from longer DNA molecule with a restriction endonuclease that produces blunt ends. Which of the following reagents would you need to tailor the ends of the fragments so it could be inserted into an expression vector at unique EcoRI cloning site?

(a) DNA polymerase (d) ATP

(b) All four dNTPs (e) DNA ligase

(c) EcoRI restriction endonuclease (f) Polynucleotide kinase

What would happen if the restriction fragment had an internal EcoRI site?

c, d, e, f.

The oligonucleotide must have a 5„-phosphate group to serve as a substrate for DNA ligase. Therefore, ATP and polynucleotide kinase would be used, as would bacteriophage T4 DNA ligase and ATP, to join the duplex form of the palindromic (self-complementary) oligonucleotide to the blunt-end fragment. Finally, the fragment with the linker covalently joined to it would be cut with EcoRI endonuclease to produce cohesive ends that match those of the cut vector. It is assumed that the fragment itself lacks EcoRI sites because, if one or more internal EcoRI sites were present, the fragment would be cut when it is treated with the enzyme to generate the cohesive ends. Such fragmentation of the DNA would complicate the joining reaction by forming product with various combinations of EcoRI-joined ends.

4. cDNA (komplementarny DNA, ang. complementary DNA) – DNA uzyskany poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA uzyskanego z komórki. Nazwę tę nosi zarówno pojedyncza cząsteczka, jak i cała biblioteka genowa uzyskana w ten sposób. Ze względu na to, że mRNA pochodzi tylko od aktywnych transkrypcyjnie genów, cDNA reprezentuje w pewnym sensie zestaw informacji genetycznej, wykorzystywanej w komórce, tkance lub narządzie (zależnie od źródła komórek). Cechą charakterystyczną jest brak intronów, co jest wynikiem potranskrypcyjnej obróbki mRNA. W związku z tym na podstawie cDNA i znajomości kodu genetycznego można przedstawić profil syntetyzowanych w komórce białek oraz wykryć nowe, jeszcze nie zidentyfikowane cząsteczki białkowe.

5.Składy roztworów używane w PCR:

- matryca - zazwyczaj używa się od 5-30 ng. Duża ilość matrycy objawia się powstawaniem niespecyficznych produktów PCR.

- startery - starter przedni oraz wsteczny - w ilości zazwyczaj 50 pmoli. Są czynnikiem limitującym, muszą posiadać wolne końce 3’. Zbyt wysokie stężenie spowoduje powstawanie niespecyficznych produktów PCR. Procentowa zawartość par GC powinna się mieścić w przedziale 40-60%.

Mam jeszcze zapisane: dla ssDNA - max 100pmoli

dla dsDNA - max 50pmoli

Z każdą reakcją ubywa starterów, bo są wbudowywane do protduktu. W analityce zużywamy dużo mniej starterów - nawet rzędu fmoli.

- dNTP - w stężeniu końcowym = 200 uM. Nie może być ich zbyt dużo, ponieważ odmiareczkowują jony magnezu. Jeżeli jest dużo dNTP - reakcja przebiega w kierunku polimeryzacji. Stężenie wszystkich 4 muszą być równe. Powinny być rozpipetowane na małe partie(termodynamicznie niestabilne-częste rozmrażanie). Jeśli jest ich za mało, to też źle, ponieważ reakcja może się cofać (jeśli polimeraza ma aktywność odcinającą)

- dwuwartościowe jony Mg - występują przeważnie w buforze, jony Mg2+ wiążą się do dNTPów, starterów i matryc, jeżeli próbka DNA zawiera EDTA stężenie powinno być podwyższone-1cz. EDTA wiąże 1 jon Mg2+. Jeżeli siężenie będzie za wysokie powstaną niespecyficzne produkty PCR, jeśli za niskie wydajność PCR będzie słaba. Ich stężenie dobiera się w zależności od warunków.

- polimeraza (1-1,5u) - w zależności od polimerazy - dodawana do mieszaniny, lub podczas PCR w tzw. hot start. Zbyt wysokie stężenie polimerazy prowadzi do powstawania niespecyficznych produktów PCR. Jeżeli w mieszaninie obecne są inhibitory (np. zanieczyszczona matryca) stężenie polimerazy powinno zostać podwyższone (2-3u)

- bufor dla polimerazy-pH 8,3-8,8 w temp 25C, kiedy inkubujemy w 72 C pH mieszaniny reakcyjnej spada do ok. 7,2. Drugim rodzajem buforów stosowanych w do PCR są bufory fosforanowe, ale później zjadają ten bufor bakterie.

- jony jednowartościowe-siła jonowa, pH

- woda

Kolejność dodawania roztworów:

1. woda

2. bufor dla polimerazy

3. dNTP

4. startery

5. matryca

6. Mg2+

Redukcja niespecyficznego parowania i wzrost wydajności amplifikacji: formamid, dimetylosulfotlenek, glicerol

Inhibotory PCR: proteinaza K, jonowe detergenty, heparyna, hemoglobina, bromofenol, ksylenocyjanol, zanieczyszczenia

W PCR preparatywnym i analitycznym objętość próbki - 50 ul - aby powstające DNA miało się gdzie rozchodzić.

W PCR diagnostycznym - 10-20 ul

6. Polimerazy- enzymy mające zdolność syntezy nici komplementarnej na matrycy pojedynczej nici kwasu nukleinowego. W zależności od syntetyzowanej nici wyróżnia się polimerazy DNA syntetyzujące nić DNA (np. w procesie replikacji DNA) oraz polimerazy RNA syntetyzujące nić RNA (np. w procesie transkrypcji). W zależności od wykorzystywanej przez polimerazę matrycy mówi się o polimerazach zależnych od DNA, jeśli matrycą jest DNA, i polimerazach zależnych od RNA, jeśli matrycą jest RNA. Polimerazy są powszechnie używane w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Przykładowo polimeraza Taq (polimeraza DNA zależna od DNA pochodząca z bakterii Thermus aquaticus) jest używana w reakcji PCR.

Aktywności:

a) nukleazowa - umożliwia naprawianie błędów w DNA przez eliminację nukleotydów niedopasowanych do matrycy (3’->5’ egzonukleazowa), inaczej korygująca (jest wymagana w PCR).

b) polimerazowa - synteza w kierunku 5’->3’.

c) 5’->3’ egzonukleazowa - odpowiada za usuwanie starterów (nie jest konieczna w PCR).

Polimeraza Aktywność

DNA I 3’->5’ , 5’->3’

fragment Klenowa 3’->5’

DNA II 3’->5’

DNA III 5’->3’

Inaktywacja: jonowe detergenty-SDS, ekstrakcja w układzie fenol/chloroform

Nazwa	Funkcja
Polimerazy prokariotyczne
Polimeraza DNA I	Usuwa starter I wypełnia powstałe po jego usunięciu luki w nici opóźnionej
Polimeraza DNA II	Naprawa DNA
Polimeraza DNA III	Główny enzym syntezujący DNA
Polimerazy eukariotyczne
Polimeraza DNA α	Polimeraza inicjatorowa
Podjednostka o aktywności prymazy	Syntetyzuje starter RNA
Podjednostka syntezująca DNA	Dodaje około 20 nukleotydów do startera
Polimeraza DNA β	Naprawa DNA
Polimeraza DNA δ	Główny enzym syntetyzujący DNA

7. Projektowanie starterów

- startery powinny składać się z 15-30 nukleotydów, najlepsza długość to 18 nukleotydów.

- temperatura topnienia starterów nie powinna być większa niż 70 stopni (tutaj mam coś o optymalnej temperaturze dla polimerazy) i mniejsza niż 54 stopnie.

- wzór na obliczanie temperatury topnienia: Tm=4*(G+C) + 2*(A+T)

- starter nie powinien kończyć się na a ani na t

- jeżeli startery przedni i wsteczny różnią się temperaturą topnienia, wtedy do obliczenia całkowitej temperatury topnienia bierzemy wartość niższą i odejmujemy od niej 2 stopnie.

Podnosząc temperaturę zwiększamy specyficzność; obniżając temperaturę - zwiększamy prawdopodobieństwo hybrydyzacji, ale hybrydyzacja ta traci na specyficzności, startery niekompletnie parują do matrycy.

- do projektowanych starterów trzeba wrzucić wąsy, na które składa się miejsce restrykcyjne danego enzymu.

- ostatecznie startery trzeba jeszcze zaopatrzyć w reszty bogate w G i C (zazwyczaj jest to GCCCGG), chyba, że wąsy posiadają dużo tych reszt, więc dokładamy parę A i T. Starter zaopatruje się w te reszty, ponieważ enzymy restrykcyjne, których używamy są to endonukleazy, czyli tną wewnątrz. Bez tych reszt musielibyśmy użyć egzonukleazy.

- pamiętać trzeba o ramce odczytu dla enzymów, czasami pożądane jest aby wprowadzić kodon Stopu. (UAA, UAG, UGA)

-startery przedni i wsteczny nie powinny ze sobą parować

-starter nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów

-brak traktów polipurynowych oraz polipirymidynowych oraz dwunukleotydowych powtórzeń

8.

9.Otwarta ramka odczytu lub ORF (z ang. Open Reading Frame) jest każdą sekwencją DNA lub RNA, która potencjalnie może ulec translacji na białko. W genie ORF mieści się pomiędzy kodonem'START' (lub sekwencją START), a kodonem 'STOP'. ORF-y odnajduje się zwykle podczas przeczesywania sekwencji DNA przy poszukiwaniu potencjalnych genów. Dla różnych organizmów, z powodu różnorodności sekwencji 'START' istnieją zatem różne ORF-y. Typowy algorytm poszukiwania ORF uwzględni zatem kod genetyczny danego organizmu (łącznie z możliwymi jego odmianami) i wyszuka wszelkie możliwe ORF (z czego nie wszystkie muszą być prawidłowe).

W rzeczywistości, obecność ORF, szczególnie długiego, jest zazwyczaj dowodem na obecność genu, gdzieś w okolicznej sekwencji. W takim wypadku ORF jest częścią sekwencji kodującej, podlegającej translacji przez rybosomy. Jednak można spotkać także ORF-y nie będące częścią genu - zazwyczaj są one krótkie i kończą się zaledwie po kilku kodonach.

Po sekwencjonowaniu genu jest bardzo ważne, żeby wyznaczyć jego ORF. Dla organizmów z dwuniciowym DNA jego sekwencja może być odczytana na sześć różnych sposobów - trzy na nici wiodącej i trzy na nici opóźnionej. Zazwyczaj najdłuższa sekwencja, nie przerwana kodonem 'STOP' w obrębie genu jest jego ORF-em. Jakkolwiek sprawdza się to dla prokariota, u eukariota sprawa komplikuje się, gdyż ich geny zawierają długie sekwencje niekodujące - introny. ORF dla takich genów odnajduje się badając zazwyczaj mRNA będące ich produktem.