ćwiczenie nr 2

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

Temat: BIAŁKA

Wtorek 8¹⁵-12⁰⁰

Opiekun grupy :

Dr inż. A. Bujacz Marta Wujek

Aleksandra Kosiorek

Przemysław Woiński

1. WSTĘP

PODZIAŁ BIAŁEK

Białka należą do związków chemicznych typu wielkocząsteczkowych. Wśród składników żywych organizmów białka należą do substancji, które posiadają decydujące znaczenie dla procesów biochemicznych determinujących zjawiska życiowe.
Ze względu na złożoną i wielopostaciową strukturę molekularną, białka występują w różnych formach oraz wykazują różnorodność właściwości biologicznych. Są zasadniczym i ilościowo najobficiej występującym składnikiem komórek. W suchej masie ciała dorosłego człowieka zawartość białek sięga 56%. Białka są obecne w każdej komórce, we krwi, płynach tkankowych i mózgowo-rdzeniowych, limfie itp.
Odgrywają dużą rolę w regulacji ciśnienia osmotycznego, stężenia jonów wodorowych spełniając rolę buforów, dalej biorą udział w krzepnięciu krwi i procesach odpornościowych. Białka jako enzymy spełniają rolę katalizatorów, a jako hormony regulują przemianę materii.
Wszystkie białka zawierają azot (ok. 16%), poza tym węgiel, wodór, tlen, a często i inne pierwiastki, np. fosfor, żelazo i miedź.

Białka dzieli się na dwie obszerne klasy;

• białka fibrylarne (inaczej włókniste lub włókienkowe)

• białka globuralne (inaczej białka kuliste lub kłębuszkowe)

Białka fibrylarne

Białka fibrylarne są materiałem budulcowym organizmów zwierzęcych. Głównymi białkami fibrylarnymi są:

• keratyna (białko znajdujące się we włosach, paznokciach i mięśniach oraz rogach, kolcach i piórach zwierząt)

• kolagen (białko znajdujące się w ścięgnach, skórze, kościach i w tkance łącznej występującej między komórkami).

Cząsteczki tej grupy białek są długie i nitkowate, mają skłonność do układania się obok siebie i tworzenia włókien.

Białka globuralne

Białka globuralne są pofałdowane, dzięki czemu tworzą zwarte jednostki, które często przybierają kształty kuliste. Przedstawicielami tej grupy białek są:

• albuminy (albumina surowicy krwi, owoalbumina występująca w białku jaja, laktoalbumina)

• globuliny (globulina surowicy, fibrygen krwi, globulina jaja występująca w białku jaja, laktoglobulina).

Białka globuralne pełnią cały szereg funkcji związanych z podtrzymaniem i regulacją procesów życiowych; pełnienie tych funkcji wymaga ruchliwości białek, a zatem ich rozpuszczalności. Z tych białek są zbudowane: wszystkie enzymy, wiele hormonów (insulina, tereoglobulina, przeciwciała, hemoglobina, fibrynogen).
Pod względem chemicznym białka są wielkocząsteczkowymi polimerami.
Białka posiadają strukturę koloidalną
Oprócz wcześniej opisanego podziału białek, często za podstawę klasyfikacji bierze się właściwości fizykochemiczne. Uwzględniając właściwości fizykochemiczne białka dzielimy na:

• białka proste albo proteiny (poddane procesowi hydrolizy rozpadają się wyłącznie na aminokwasy)

• białka złożone albo proteidy, których część białkowa jest związana ze składnikiem niebiałkowym zwanym grupą prostetyczną.

Białka proste - proteiny

Do białek prostych zaliczamy te, które hydrolizując dają jedynie aminokwasy. Białka proste dzielimy:

• protaminy - posiadają masę cząsteczkową o przewadze zasadowych aminokwasów.

• albuminy - białka zwierzęce i roślinne. W skład albumin wchodzą wszystkie aminokwasy; dobrze rozpuszczają się w wodzie. Spotykamy je w białku jaja kurzego, w osoczu krwi i mleku.

• globuliny - szeroko rozpowszechnione białko w świecie roślinnym i zwierzęcym. Spotykane są w osoczu krwi, mleku i białku jaja kurzego

• histony - występują w jądrze komórkowym. Bogate w histony są gruczoły grasicy

• prolaminy - białka roślinne, nierozpuszczalne w wodzie. Są składnikiem mąki. Prolaminy zawierają dużo kwasu glutaminowego

• gluteliny - podobne do prolamin

• keratyny - należą do nich przede wszystkim białka tkanki łącznej tworów zrogowaciałych (paznokcie, pióra i włosy)

Białka złożone - proteidy

Są to białka, w których część białkowa związana jest ze składnikiem prostetycznym. Białka złożone hydrolizują na aminokwasy, kwasy, cukry, barwniki, witaminy, itp. Do białek złożonych zaliczamy:

• nukleoproteidy - są podstawową masą komórki i wchodzi w skład protoplazmy.

• chromoproteidy - białka posiadające jako grupę prostetyczną substancję barwną. Do tej grupy należy hemoglobina - substancja barwna czerwonych ciałek krwi.

• metaloproteidy - białka zawierające w części niebiałkowej grupę prostetyczną składającą się z metali, które jednak nie wchodzą w skład substancji barwnej. Do tych białek należy ferrytyna, zawierająca około 20% żelaza, które następnie dostarcza dla syntezy hemoglobiny

• fosfoproteidy - zawierają kwas fosforowy związany z białkiem w postaci estru. Fosfoproteidami są: kazeina mleka, witelina żółtka jaj.

• glikoproteidy - białka zawierające w grupie prostetycznej cukrowce

• lipoproteidy - białka, które w grupie prostetycznej zawierają lipidy. spotykane są w osoczu krwi, żółtku jaja kurzego.

STRUKTURA BIAŁEK

Strukturę białek najczęściej rozpatruje się w czterech aspektach, tj.

• struktury pierwszorzędowej - określa, w jaki sposób atomy w cząsteczkach białka są z sobą połączone wiązaniami kowalencyjnymi, czyli jak tworzą się łańcuchy. Inaczej struktura pierwszorzędowa określa kolejność aminokwasów w łańcuchu białkowym.

• struktury drugorzędowej - określa, w jaki sposób utworzone łańcuchy są ułożone w przestrzeni, czyli jakie formy przestrzenne (spirale, arkusze albo kule) tworzą one za pomocą wiązań wodorowych, łączących różne łańcuchy lub różne części tego samego łańcucha

• struktura trzeciorzędowa - określa najbardziej korzystne uporządkowanie przestrzenne poszczególnych części cząsteczki białka z punktu widzenia energetycznego; zależy od oddziaływań między łańcuchami bocznymi jednej lub większej liczby makrocząsteczek.

• struktura czwartorzędowa - określa sposób przestrzennego powiązania kilku cząsteczek  w jedną złożoną strukturę białka.

DENATURACJA BIAŁKA

Denaturacja białka polega ogólnie na takiej zmianie jego budowy przestrzennej, która powoduje zanik aktywności biologicznej (tj. np. aktywności enzymu białkowego). Czynniki wywołujące denaturację, powodują na ogół rozerwanie w pierwszym rzędzie słabych oddziaływań, utrzymujących struktury wyższych rzędów (np. rozerwanie mostków dwusiarczkowych, zniesienie oddziaływań wodorowych, itp.).
Wiele różnych substancji działa na białka denaturująco. Wśród nich są kwasy, zasady, alkohol, stężone roztwory mocznika. Czynnikiem denaturującym jest również temperatura. W większości wypadków denaturacja białek jest procesem nieodwracalnym.

1. WYKONANIE ĆWICZENIA

	EKSTRAHOWANIE ALBUMIN I GLOBULIN
Cel	Próba potwierdzająca obecność albumin i globulin w mączce grochowej
Użyte odczynniki	1 g mączki grochowej 25 ml 0,5M roztworu KCl 8 ml wody 8 ml 0,5M KCl
Przebieg doświadczenia	Odważony 1 gram mączki grochowej ekstrahowaliśmy roztworem KCl. Mieszaninę odwirowaliśmy. W pierwszej probówce umieściliśmy ciecz nadosadową i przeprowadziliśmy próbę biuretową (przeprowadziliśmy równolegle próbę dla białka jaja kurzego). W dwóch probówkach umieściliśmy ciecz nadosadową, do jednej dodaliśmy wodę, do drugiej KCl.
Obserwacje	Przeprowadzona próba biuretowa wykazała obecność białka. W probówce, z KCl nie powstał żaden odczyn, natomiast w probówce, do której dodaliśmy wody wytrącił się osad, który zniknął po dodaniu KCl.
Wnioski	W wyizolowanym z mączki grochowej białku znajdują się globuliny, które nie są rozpuszczalne w wodzie, natomiast są dobrze rozpuszczalne w obecności jonów soli.

	WYDZIELANIE GLUTENU
Cel	Próba potwierdzająca obecność glutenu w mące pszennej
Użyte odczynniki	30 g mąki pszennej niewielka ilość wody 30 ml 0,2M roztworu NaOH
Przebieg doświadczenia	Z mąki pszennej i wody przygotowaliśmy twarde ciasto, które (pozostawione na 30 minut celem spęcznienia) płukaliśmy pod strumieniem zimnej wody, wypłukując skrobię, aż do uzyskania gumowatej konsystencji. Pozostałość rozpuściliśmy w roztworze NaOH i ciecz nadosadową badaliśmy przeprowadzając próbę biuretową.
Obserwacje	Po przeprowadzonej próbie biuretowej ciecz pobrana znad osadu zabarwiła się na niebieskofioletowo.
Wnioski	W wyniku wypłukania skrobi z uzyskanego ciasta wyizolowaliśmy gluten, który zawiera znaczną ilość reszt kwasu glutaminowego i rozpuszcza się dobrze w roztworach zasad.

	WYSALANIE BIAŁEK
Cel	Próba potwierdzająca wypadanie białek z roztworu
Użyte odczynniki	10 ml 1% roztworu białka jaja kurzego stały (NH4)2SO4 0,5M KCl 2-3 krople 5% kwasu trójchlorooctowego
Przebieg doświadczenia	Do roztworu białka kurzego dodawaliśmy siarczan amonowy aż do nasycenia roztworu soli. Następnie całość przesączyliśmy i osad pozostały na sączku rozpuściliśmy roztworem KCl. Roztwór z osadu badaliśmy próbą biuretową, natomiast do przesączu dodaliśmy kilka kropli kwasu trójchlorooctowego.
Obserwacje	Po przeprowadzonej próbie biuretowej ciecz zabarwiła się na niebieskofioletowo. Po dodaniu TCA do przesączu nie pojawił się żaden odczyn.
Wnioski	Wysalanie białek polega na dehydratacji cząsteczek białka. W wyniku wysolenia białko znalazło się w całości w roztworze rozpuszczonego osadu, natomiast brak osadu w przesączu po dodaniu TCA świadczy o całkowitym wysoleniu białka.

	BIAŁKA JAKO KOLOIDY
Cel	Próba potwierdzająca działanie koloidów białkowych
Użyte odczynniki	2 x 1ml 0,01M roztworu azotanu srebra 1 ml 1% roztworu białka jaja kurzego 1 ml wody 0,01M roztwór NaCl
Przebieg doświadczenia	Do dwóch probówek odmierzyliśmy roztwór azotanu srebra, do jednej dodaliśmy białko kurze, do drugiej wodę. Do obu wprowadziliśmy roztwór chlorku sodu.
Obserwacje	W probówce z wodą wytrącił się osad, w postaci zawiesiny, która po pewnym czasie opadła na dno naczynia, natomiast w probówce z białkiem reakcja nie zaszła.
Wnioski	W probówce z białkiem nie obserwujemy wtrącenia się osadu, ponieważ białko wykazuje ochronne działanie koloidów wobec hydrofobowego roztworu soli srebra.

	STRĄCANIE BIAŁEK ZA POMOCĄ KATIONÓW I ANIONÓW
Cel	Określanie charakteru białka na podstawie pH
Użyte odczynniki	kilka kropli 10% roztworu siarczanu miedzi kilka kropli 10% roztworu octanu ołowiu kilka kropli 10% roztworu wolframianu sodu po 2 ml 1% roztworów białek jaj kurzych o pH 8; 4,7; 3
Przebieg doświadczenia	Do trzech probówek odmierzyliśmy po 2 ml roztworów białka kurzego o pH 3; 4,7; 8. Do probówek dodawaliśmy poszczególne odczynniki.
Obserwacje	ODCZYNNIK ROZTWÓR BIAŁKA KURZEGO pH=8 siarczan miedziowy + octan ołowiu (II) + wolframian sodowy - + reakcja zaszła, powstał białczan - reakcja nie zaszła, nie powstał białczan
Wnioski	Powstałe w wyniku reakcji substancje mają charakter soli i są określane jako białczany. Punkt izoelektryczny białka jaja kurzego występuje przy pH 4,7, w związku z czym posiada ono charakter obojnaczy i nie wiąże ani kationów ani anionów. Białko o pH niższym niż pI posiada charakter kationu reagującego z anionem (pH=3), natomiast o pH wyższym posiada charakter anionu reagującego z kationem (pH=8).

	WPŁYW KWASÓW ORGANICZNYCH NA BIAŁKA
Cel	Określanie działania niektórych kwasów organicznych na białka
Użyte odczynniki	3 x 1 ml 1% roztworu białka jaja kurzego 1 ml 6% roztworu kwasu sulfosalicylowego 1 ml 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego 1 ml 5% roztworu kwasu octowego
Przebieg doświadczenia	Do trzech probówek odmierzyliśmy po 1 ml roztworu białka kurzego, do kolejnych probówek dodawaliśmy poszczególne kwasy organiczne.
Obserwacje	KWAS OBSERWACJE kwas sulfosalicylowy + kwas trójchlorooctowy + kwas octowy - + reakcja zaszła - reakcja nie zaszła
Wnioski	Poszczególne kwasy organiczne denaturują białka, tworząc z nimi nierozpuszczalne połączenia. Przykładami takich kwasów są kwas sulfosalicylowy i trójchlorooctowy. Kwas octowy jest kwasem słabym, dlatego nie dał żadnego odczynu.

	DENATURACJA CIEPLNA
Cel	Próba potwierdzająca wpływ temperatury na strukturę białka
Użyte odczynniki	3 x 2ml roztworu białek jaj kurzych o pH 8; 4,7; 3 2 x 5ml 0,1M roztworu buforu octanowego
Przebieg doświadczenia	Do trzech probówek odmierzyliśmy po 2 ml roztworów białka kurzego o pH 3; 4,7; 8. Próby umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut, po czym dodaliśmy po 5 ml buforu octanowego do skrajnych prób pH.
Obserwacje	W białku o pH=3 nie zaobserwowaliśmy żadnej zmiany, białko o pH=4,7 uległo denaturacji, natomiast białko o pH=8 wytrąciło osad, który zgęstniał po dodaniu buforu.
Wnioski	Białko o pH=pI wytworzyło koagulat w wyniku denaturacji cieplnej. W przypadku pH 3 i 8 koagulaty nie powstały. Białko o pH=8 uległo częściowej denaturacji.