Oznaczanie białek w próbkach środowiskowych

Oznaczanie białek metodą Lowry’ego

W metodzie Lowry’ego (Lowry i wsp., 1951) ilościowego oznaczania białka wykorzystuje się czułą reakcję, jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem fenolowym Folina-Ciocalteu’a. Reakcja przebiega w dwóch etapach: pierwszy polega na przyłączeniu jonów miedzi do wiązań peptydowych, w drugim etapie następuje redukcja kwasu fosforowolframowego i fosforomolibdenowego do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem oraz tyrozynę i tryptofan, zawarte w oznaczanym białku. Redukcja kwasu foso molibdenowego zachodzi szybko w środowisku o pH około 10. Jednocześnie w środowisku takim kwas ten jest nietrwały i łatwo ulega hydrolizie do kwasu fosforanowego i molibdenowego. Aby temu zapobiec należy po dodaniu odczynnika Folina, badaną próbkę od razu zamieszać. Oznaczania ilościowego powstałych barwnych związków dokonuje się metodą spektrofotometryczną.

Wykonania oznaczenia

MATERIAŁ: rozcieńczone mleko, wyciąg z drożdży, roztwór z białka jaj.

ODCZYNNIKI: roztwór A, roztwór E (odczynnika Folina-Ciocalteu’a)

Do probówek odmierzyć 0,4ml odpowiednio przygotowanej próbki, dodać 2ml roztworu A:

SKŁAD ROZTWORU A:

• 0,5 cm³ 2% (w/v) roztworu winianu sodu i potasu,

• 0,5 cm³ 1% (w/v) roztworu CuSO₄*5H₂O przygotowanym w 2% alkalicznym roztworze Na₂CO₃.

Dobrze wymieszać. Badanie prowadzić w minimum 2 powtórzeniach. Równocześnie wykonać próbę ślepą.

Próbkę odstawić na 10min, a następnie bardzo szybko dodać 0,2ml odczynnika E (odczynnika Folina-Ciocalteu’a) i mieszać 2 sek.

Po 30 min inkubacji w ciemnym miejscu zmierzyć absorbancję przy długości fali 750nm.