1. Metody unieruchamiania (immobilizacji) enzymów

   1. Polegające na przyłączeniu enzymu do powierzchni nośnika

      • Dzięki fizycznej adsorpcji biokatalizatora

      • Wiązanie z udziałem oddziaływań jonowych przez wytworzenie wiązań kowalencyjnych

      • Jeśli bezpośrednia reakcja nie jest możliwa stosuje się substancje posiadające co najmniej 2 grupy chemiczne zdolne do reakcji z nośnikiem i z enzymem

      • Substancje te zwiększają odległość pomiędzy cząsteczkami unieruchomionego enzymu a powierzchnią nośnika ułatwiając dostępu substratom do centrum katalitycznego

   2. Z zastosowaniem sorbentów

      • Gdy nie ma potrzeby zbyt trwałego wiązania enzymu

      • Ich zaletą jest nieskomplikowana procedura i możliwość łatwej regeneracji poprzez wymycie nieaktywnego już białka

      • Brak zmian struktury cząsteczek enzymu

      • Niewielka energia wiążąca białka jest przyczyną szybkiej desorpcji enzymu podczas działania reaktora

   3. Oddziaływania jonowe

      • Powodują silniejsze unieruchamianie enzymów

      • Występują w zakresie pH przy którym zarówno enzym jak i nośnik uzyskują ładunek elektryczny

      • Jeśli gr funkcyjne enzymu i nośnika mają ładunek jednakowego znaku do zaistnienia wiązania niezbędne są dwuwartościowe kationy, sprzęgające białko za pośrednictwem mostków solnych

      • W przypadku stosowania silnych kationów lub anionitów poszerza się zakres wartości pH przy których występuje jonowe wiązanie enzymu

      • Przykłady nośników: z wiązaniami sulfonowymi

   4. Wiązania kowalencyjne

      • Nie powodują zmniejszenia aktywności operacyjnej preparatu na skutek desorpcji enzymów

      • Nie powodują denaturacji białka

      • Odbywa się z udziałem białkowych reszt lizyny, argininy, cysteiny, tyrozyny, kwasów glutaminowego i asparaginowego, aminokwasów znajdujących się w pozycji N- lub C-terminalnej

      • Jako nośniki: polimery zawierające wolne grupy aminowe, umożliwiające sprzęganie białka enzymatycznego w łagodnych warunkach za pośrednictwem aldehydu glutarowego

      • Wada: tworzenie oligomerów o zróżnicowanej długości cząstek, zmniejszenie aktywności preparatu spowodowane zmianami struktury cząstek białka i ograniczeniem dostępu substratu do centrum katalitycznego

   5. Wiązania wytworzone z substancjami dwufunkcyjnymi

      • Powodują otrzymywanie nierozpuszczalnych preparatów enzymatycznych

      • Substancje dwufunkcyjne: aldehyd glutarowy, polialdehydy, kwas bis-diazobenzydynosulfanowy

      • Preparaty różnią się od siebie: aktywnością, termo stabilnością, odpornością na działanie substancji denaturujących białka, stopniem uwodnienia, wielkością ziaren i wytrzymałością mechaniczną

   6. Sieciowanie bialek

      • Powoduje uwodnienie precypitatu, niewielką wytrzymałość mechaniczną, zróżnicowanie wielkości ziaren

      • Unieruchomiony w ten sposób enzym charakteryzuje się polepszoną termo stabilnością, trudnością w wytworzeniu preparatu o powtarzalnych właściwościach

      • Wady: powolna precypitacja wytworzonych agregatów, zmniejszenie aktywności enzymu

   7. Sieciowanie kryształów białka lub agregatów jego cząsteczek

      • Korzystne właściwości katalityczne bialek enzymatycznych agregowanych za pomocą aldehydu glut arowego

      • Uzyskane preparaty składają się z prawie czystego białka, wykazują dużą aktywność, odporność na działanie czynników denaturujących

      • Liczne oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe w kryształkach

      • Krystaliczna struktura utrudnia inaktywację

      • Warunkiem rozpowszechniania tej metody jest:

        • Polepszenie sposobów wydajnego uzyskiwania kryształów białek o optymalnym kształcie i wielkości

        • Dostępność przenikających ich strukturę kanałów, ułatwiających penetrację roztworu substratu

      • Wady: niewielkie rozmiary cząsteczek usieciowanych kryształów, zwiększenie oporów przepływu substratu w reaktorach kolumnowych

   8. Sieciowanie precypitatu strąconego w niedenaturujących warunkach roztworów soli, rozpuszczalnikami organicznymi, bądź polimerami niejonowymi

      • Zalety: możliwość regulacji ich specyficzności poprzez wybór odpowiedniej substancji strącającej i warunków procesu

      • Możliwość uzyskania z tego samego enzymu preparatów o rożnym powinowactwie do substratów i odporności na działanie inhibitorów

   9. Błony o selektywnej przepuszczalności

      • Spełniające funkcję separacyjną albo separacyjną i katalityczną

      • Aktywność zależy od szybkości dyfuzji substratu i produktu reakcji przez membranę

      • Membrany bez enzymu służą do zamknięcia roztworu biokatalizatora w mikrokapsułce lub w module reaktora

      • Do mikrokapsulek konieczne jest stosowanie blon przepuszczających cząsteczki substratów i produkty reakcji

      • Membrany zatrzymujące tylko cząsteczki substratu przydatne są do oddzielenia produktów reakcji od mieszaniny reakcyjnej zawierającej enzym

   10. Pułapkowanie (inkluzja)

       • Zachodzi w żelu wytwarzanego po zmieszaniu roztworów enzymu i substancji żelującej

       • Mała energia oddziaływań wiążących

       • Łatwe wymywanie biokatalizatora

       • Szybki spadek aktywności preparatu

       • Zmiany właściwości wyrobu

       • Nie nadaje się do immobilizacji hydrolaz oraz w przypadku gdy substraty lub produkty reakcji z trudnością migrują w strukturze polimeru

2. Im mobilizowane enzymy

   1. Preparaty wytworzone przez połączenie biokatalizatora z nośnikiem nierozpuszczalnym w środowisku reakcji

   2. Nierozpuszczalne agregaty cząsteczek

   3. Nierozpuszczalne agregaty kryształów białek

   4. Enzymy zamknięte w strukturze żelu

   5. Enzymy oddzielone od środowiska reakcji półprzepuszczalnymi membranami

3. Zalety unieruchamiania enzymów

   1. Stabilizacja struktury biokatalizatora przeciwdziałająca niekorzystnemu wpływowi środowiska

   2. Wzrost odporności preparatu na działanie podwyższonej temperatury, rozpuszczalników organicznych i substancji denaturujących

   3. Obniżenie inhibicji produktami reakcji

   4. Zmiana specyficzności względem inhibitorów

4. Wady

   1. Utrudniona oscylacja zmiany cząsteczek biokatalizatora podczas reakcji

   2. Ograniczony dostęp substratu do cząsteczek enzymu

   3. Obniżenie aktywności preparatu

   4. Obniżenie powinowactwa enzymu do substratu

   5. Stopniowe zmniejszanie aktywności katalitycznej enzymu

   6. Blokowanie enzymu cząsteczkami produktu

   7. Adsorpcja zanieczyszczeń działających jako inhibitory

   8. Rozwój drobnoustrojów

   9. Pozorna zmiana optymalnego pH działania enzymu

   10. Zmniejszenie powinowactwa enzymu do posiadających ładunek elektryczny cząsteczek substratu

5. Stosowane nośniki

   1. Dostosowane do:

      1. Temperatury

      2. Kwasowości

      3. Lepkości

      4. Polarności środowiska reakcji

      5. Konstrukcji używanego reaktora

   2. Przydatność substancji jako nośnika zależy od:

      1. Powierzchni właściwej

      2. Rozmiarów Ziarek

      3. Porowatości

      4. Wytrzymałości mechanicznej

      5. Ilości dostępności i rodzaju grup funkcyjnych wiążących enzym

      6. Zawartości grup hydrofilowych i hydrofobowych

   3. Modyfikacje

      1. Pokrywanie nośników warstwą reagującego z bialkiem polimeru

      2. Wbudowywanie pożądanej grupy chemicznej podczas syntezy nośnika

   4. Rodzaje

      1. Unieruchamianie w środowisku wodnym za pomocą nośników katalizowanymi lipazami

         • Emulgatory

         • Środki pianotwórcze

         • Środki żelujące

         • Surfaktany

      2. Porowate

         • Zalety: duża pwierzchnia kontaktu ze środowiskiem reakcji

         • Wady: nasilenie oporów dyfuzyjnych, utrudniony transport substratów i produktów katalizowanego procesu

      3. Polimery i kopolimery syntetyczne

         • Właściwość i pojemność enzymatyczna dostosowana do projektowanego procesu

         • Poliakryloamidy poliamidy, pochodne polistyrenu, poliakrylonitrylu lub alkoholu poliwinylowego

         • Kopolimery z grupami bezwodnikowymi

      4. Polimery pochodzenia naturalnego

         • Niski koszt

         • Eliminacja niebezpieczeństwa zanieczyszczenia produktu pozostałością substancji

         • Polisacharydy, bialka

         • Związki nieorganiczne tj szkło porowate, żel krzemionkowe

         • Zapewniają kontrolę liczebności, rozmiarów porów

         • Nie ulegają degradacji w szerokim zakresie pH i T

         • Odporne na mikrobiologiczne degradacje

      5. Nieorganiczne adsorbenty

         • Szkło porowate

         • Żel krzemionkowy

         • Tlenki metali

         • Glinokrzemiany

         • Substancje ceramiczne

      6. Ferromagnetyczne

         • Usuwane z cieczy poreakcyjnej pod wpływem pola magnetycznego

   5. Cechy

      1. Stabilność w warunkach procesu

      2. Odpornośc na degradację pod wpływem drobnoustrojów

      3. Gęstość właściwa

      4. Wytrzymałość mechaniczna dostosowana do rodzaju reaktora

      5. Kształt ziaren nośnika

      6. Gęstość ziaren nośnika

      7. Wielkość ziaren nośnika

      8. Odporność ziaren nośnika na ścieranie

      9. Zazwyczaj nierozpuszczalne, rozpuszczalne w zależności od środowiska

   6. Cechy nośników przeznaczonych do wykorzystania w reaktorach kolumnowych

      1. Wytrzymałość mechaniczna

6. Charakterystyka biokatalizatorów unieruchomionych

   1. Obniżenie kosztów

   2. Usprawnienie wytwarzania wielu produktów poprzez zapewnienie ciągłości procesu

   3. Długotrwałe wykorzystanie tej samej porcji preparatu w kolejnych szarżach produkcyjnych lub w reaktorach przepływowych

   4. Leprsza kontrola warunków reakcji

   5. Brak zanieczyszczenia produktu enzymem i innymi substancjami pochodzącymi z mało oczyszczonego preparatu biokatalizatora

   6. W przypadku enzymów proteolitycznych immobilizacja zapobiega ich autodestrukcji

7. Zastosowanie preparatów enzymatycznych w przemyśle spożywczym

   1. Im mobilizowane beta-galaktozydazy do wytwarzania produktów mlecznych przeznaczonych dla ludzi cierpiących na nietolerancję laktozy lub syropów glukozowo-galaktozowych z preparatu serwatki

   2. Im mobilizowanie lipazy ma zastosowanie w produkcji substancji smakowo-zapachowych, emulgatorów, substytutu masła kakaowego, enzymatycznej trans estryfikacji olejów: palmowego, słonecznikowego lub oliwkowego

   3. Im mobilizowana papaina, pepsyna, neutrała stosowana do zapobiegania zmętnienia piwa podczas przechowywani chłodniczego

   4. Zdolność proteaz do katalizowania syntezy wiązania amidowego wykorzystywana w procesie przemysłowego wytwarzania aspartamu

   5. Elektrody z unieruchomionymi oksydoreduktazami stosuje się do pomiaru zawartości etanolu i kontroli przebiegu fermentacji win i piwa

   6. Analizatory przydatne do określania świeżości ryb