Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – Metoda, przy użyciu której możemy powielić dowolny fragment DNA o długości od kilku do kilkuset tysięcy nukleotydów w warunkach laboratoryjnych.

Łańcuchowa reakcja polimerazy polega na przeprowadzeniu sekwencji wielokrotnego podrzewania i oziębiania mieszaniny reakcyjnej tzw. Termocyklerze, czyli urządzeniu służącym do sterowania temperaturą.Okresowe zmiany temperatury wywołują różnego typu reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie (np. 35 cykli), doprowadzają do powielenia, określonego przez startery fragmentu DNA.

PCR został opracowany w połowie lat 80-tych (1983) przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za to osiągniecie Mullis otrzymał Nagrodę Nobla (1993 r.).

Aby doszło do namnożenia określonego fragmentu DNA niezbędne są odpowiednie składowe reakcji.

Składniki mieszaniny reakcyjnej:

• wyizolowany, o odpowiedniej czystości matrycowy DNA (z tkanek, z krwi, z włosów itp.)

• środowisko reakcji (bufor, czyli roztór utrzymujący równowagę pH, jony magnezowe oraz odpowiedniej czystości woda).

• startery, inaczej primery czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy.

• Wolne nukleotydy

• termostabilna (nie ulegająca degradacji w wysokich temperaturach) polimeraza DNA. Ze względu na cenę, najcześciej używanym enzymem jest Polimeraza Taq, wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus.

Do probówek na początku wprowadza się wodę, bufor, jony magnezowe i wolne nukleotydy. Następnie wprowadza się zazwyczaj dwa primery (syntetyzujący od końca 3' i syntetyzujący od 5'), matrycowy DNA i na samym końcu dodaje się polimerazę. Kolejność wprowadzanych składników jest bardzo istotna, bo przypadkowe łączenie składowych mogłoby obniżyć lub zmienić aktywność mieszaniny. Probówki z mieszaniną przenosi się do termocyklera.

Przebieg reakcji:

Denaturacja- Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 sekund.

Annealing – hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-60 °C), przyłączają się one do matrycy. Ponieważ roztwory primerów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast dupleksów starter-matryca utworzyły się hybrydy połączonych się ze sobą dwóch nici matrycy.

Elongacja – Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie elongacji. Po ostatnim cyklu, w temperaturze 72 stopni C, przez okres zazwyczaj 5minut następuje końcowe wydłużanie.

Gdyby wydajność reakcji PCR była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2 do n-tej potęgi cząsteczek DNA. W praktyce wydajność reakcji PCR jest nieco mniejsza. Nie zmienia to jednak faktu, że PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego odcinka łańcucha DNA i że metoda ta jest bardzo czuła.

Zastosowanie metody PCR:

-badania nad genomem

-charakterystyka ekspresji genów

-klonowanie genów

-badanie żywności (identyfikacja gatunkow grzybów, wykrywanie drobnoustrojów patogennych)

Diagnostyka kliniczna

-w dermatologii : diagnostyka chorób bakteryjnych, wirusowych i grzybic, jak również genodermatoz i nowotworów skóry.

-w stomatologii: identyfikacja paciorkowcow próchnicotwórczych.

-w onkologii: diagnostyka nowotworów

-w kryminalistyce (identyfikacja przęstepców przy użyciu mikroskopijnych próbek DNA znalezionych na miejscu zbrodni)

-identyfikacja osób zaginionych

-w paleontologii (identyfikacja i namnożenie skamieniałych cząsteczek organizmów)

PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu badaniach genetycznych ponieważ:

-Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu - wystarczy znajomość sekwencji nukleotydów w odcinkach oskrzydlających gen.

-Stosowane startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100%. Pozwala to na amplifikację wariantów tego samego genu, które różnią się od siebie niewielkimi zmianami w sekwencji.

-Jednocześnie jest to metoda specyficzna - przy doborze odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA

-jest to metoda bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA.