ANALIZA I OCENA JAKOŚCIOWA BIAŁEK

ĆWICZENIE 1: Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka w surowicy krwi metodą biuretową

Zasada metody:

Białka i peptydy zawierające wiązania peptydowe tworzą w środowisku zasadowym z jonami Cu²⁺ barwne kompleksy. Nazwa „reakcja biuretową" pochodzi od biuretu, czyli dimocznika (produktu kondensacji dwóch cząsteczek mocznika), który daje reakcję barwną z Cu"⁺ w środowisku alkalicznym. W ilościowym wiązaniu się jonów miedzi przeszkadza obecność soli amonowych i siarczanu magnezu.

Odczynniki:

1. Odczynnik biuretowy

2. R-r albuminy 60g/l

Wykonanie:

Do probówek odmierzyć według schematu:

	Próba badana B	Próba standardowa S	Próba kontrolna K
Badany r-r białka [ml]	0,05	-	-
Roztwór wzorcowy [ml]	-	0,05	-
Woda destylowana [ml]	-	-	0,05,
Odczynnik biuretowy [ml]	2,50 .	2,50	2,50

Po dokładnym wymieszaniu inkubować przez 30 min, a następnie zmierzyć absorbancję próby badanej i standardowej wobec próby kontrolnej przy długości fali 545

nm.

Obliczanie wyników:

całkowite stężenie białka [g/1] = (abs. próby bad./abs. próby std.) x 60

'

ĆWICZENIE 2: Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka metodą Lowry'ego

Zasada metody:

W metodzie tej końcowa barwa pochodzi z dwóch odczynów: reakcji biuretowej białka z jonami Cu"⁺ w środowisku zasadowym i redukcji odczynnika fosforomolibdeno+fosforowolframowego (odczynnika Folina-Ciocalteu) do odpowiednich tlenków, przez obecne w białkach tyrozynę i tryptofan oraz przez związaną uprzednio z białkiem miedzią. Metoda Lowry'ego pozwala oznaczyć białka w stężeniu kilku fg/ml. Jest to metoda bardziej czuła od metod spektrofotometrycznej i biuretowej. Stosuje się ją do oznaczania stężenia białka w materiale biologicznym, w którym jest go bardzo mało. Wadę tej metody stanowi fakt. że poszczególne białka (w zależności od składu aminokwasowego) dają różną intensywność zabarwienia, a zatem mierzona absorbancja powinna być odczytywana z krzywej wzorcowej, sporządzonej dla konkretnego białka.

Odczynniki:

1. Alkaliczny r-r miedzi

2. Odczynnik Folina-Ciocalteu

3. Wzorcowy r-r białka

4. Badany r-r białka

Wykonanie

Do probówek odmierzyć według schematu:

	Próba badana B	Próba kontrolna K
Badany roztwór białka [ml]	1,0	-
Woda destylowana [ml]	-	1,0
Alkaliczny roztwór miedzi [ml]	5,0	5,0
		inkubować 10 minut w temp. pokojowej
Odczynnik Folina-Ciocalteu [ml]	0,5 0,5

Zawartość probówek energicznie wymieszać. Inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć absorbancję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali 650 nm.

Stężenie białka w próbie badanej odczytać z krzywej wzorcowej.

Wykonanie krzywej wzorcowej:

Do sześciu probówek oznaczonych numerami 0-5 odmierzyć podane w tabeli obję­tości roztworu wzorcowego białka (o stężeniu 20 mg/100 ml) i 0,9% roztworu NaCl:

	0	1	2	3	4	5
Wzorcowy roztwór białka [ml]	-	0,2.	0,4	0,6	0,8	1,0
0,9% NaCl [ml]	1,0,	0,8	0,6	0,4	0,2	-
Stężenie białka [jj.g/mi]	0	40	80	720	160	200

Do wszystkich probówek dodać 5 ml alkalicznego roztworu miedzi. Inkubować 10 min w temp. pokojowej. Następnie dodać 0,5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu i energicznie wymieszać. Po upływie 30 minut zmierzyć absorbancję prób od 1-5 wobec próby O (próba kontrolna) przy długości fali 650 nm.

Cwiczenie 3.- Denaturacja i koagulacja białek

Zasada met ody:

Denaturacja połączona z wytrącaniem się białek zachodzi pod wpływem czynników fizycznych /np. podwyższona temperatura/ bądź __ chemicznych /mocne kwasy, metale ciężkie, alkaloidy/. Jest to zmiana IV-, III-, i II-rzędowej struktury białka. Powstaje wtedy zawiesina o charakterze koloidowym. Dodatek soli powoduje wysolenie zawiesiny i zbicie się w kłaczki /koagulacja/.

Odczynniki:

1. R-r białka jaja kurzego

2. 5% r-r NaCL

3. Stężony kwas azotowy

4. 20% octan ołowiawy

5. 2% r-r węglanu sodowego

6. 1% r-r kwasu octowego

WYKONANIE:

Do 1 ml r-r białka jaja kurzego dodajemy 1 kroplę 1% kwasu octowego (denaturacja). Po dodaniu kilku kropli r-r soli obojętnej (np. NaCL) wytwarza się gęsty, kłaczkowaty osad (koagulacja). Osad zadać r-rem 2% węglanu sodowego, wówczas obserwujemy rozpuszczenie się osadu.

Na 2 ml stężonego kwasu azotowego nawarstwiamy 1 ml r-ru białka jaja kurzego. Powstaje pierścień denaturowanego białka.

Do 1 ml r-ru białka jaja kurzego dodajemy kilka kropli octanu ołowiawego. Wypada osad nierozpuszczalny w wodzie, ani w nadmiarze odczynnika. Białko ulega tu denaturacji i koagulacji.

Ćwiczenie 4 - Wysalanie białek.

Zasada metody.

Białka wykazują różną zdolność wysalania się z roztworów zależnie od rodzaju białka oraz użytej soli. Czynnikiem najsłabiej wysalając jest chlorek sodu, silniej siarczan magnezu, najsilniej - siarczan amonu. Wysalanie jest procesem odwracalnym. Wykorzystanie różnej zdolności wysalania rozmaitych białek pozwala na oddzielenie ich od siebie. Tak np. globuliny wysalają się z roztworu przez półnasycenie siarczanem amonowym, podczas gdy albuminy pozostają w takim roztworze i ulegają wytrąceniu dopiero przy całkowitym nasyceniu tą solą. Mechanizm wysalania polega na odciągnięciu wody z micelli białkowej. Drobina białka pozbawiona ochronnego płaszcza wodnego wypada z roztworu.

.

Odczynniki:

1. Roztwór białka jaja kurzego.

2. 2% roztwór węglanu sodowego.

3. Nasycony roztwór (NH4)2SO4

4. (NH4)2SO4 in subst.

Wykonanie:

Do jednej probówki odmierzamy 5 ml r-r białka jaja kurzego, do drugiej 5 ml surowicy i słabo alkalizujemy przez dodanie 1-2 kropli 2% węglanu sodowego. Następnie wprowadzamy do obu probówek po 5 ml nasyconego r-ru siarczanu amonowego. Odsączamy wytrącony osad globulin. Z kolei wysycamy pozostały r-r siarczanem amonowym przez dodanie (NH4)2SO4 in subst i energicznie wytrząsamy. Wytrąca się osad albumin. Otrzymane osady rozpuścić w wodzie i porównać obydwie próby.

---