Usg molekularne - obecny stan wiedzy i przyszłe perspektywy
Celowane, wzmocnione kontrastem usg (usg na poziomie cząsteczkowym) jest nowo powstającą metodą badania obrazowego, która łączy w sobie zalety ultrasonografii i środków kontrastowych wiążących określone cząsteczki obecne w tkankach, przez co umożliwia uwidocznienie procesów zachodzących na tym poziomie. Po podaniu dożylnym kontrast gromadzi się w miejscach o nasilonej koncentracji określonych cząsteczek i dzięki temu dochodzi do wzmocnienia sygnału widocznego w usg. Autorzy cytowanej pracy przedstawiają obecne zaawansowanie i kierunki rozwoju prac nad omawianą techniką. Zwracają uwagę na możliwości udoskonalenia środków kontrastowych i wymagania techniczne, którym musi sprostać aparatura. Wreszcie prognozują, w jaki sposób ta nowatorska metoda może okazać się przydatna klinicznie.
Na podstawie artykułu: Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Deshpande N, Needles A, Willmann JK.. Clin Radiol 2010 Jul;65(7):567-81.
W ostatnich latach usg na poziomie cząsteczkowym stało się obiecującym narzędziem do obrazowania procesów zachodzących na poziomie tkankowym. Posiada wszystkie zalety usg takie jak wysoka i odwracalna rozpuszczalność kontrastu w tkankach, niewytwarzanie promieniowania jonizującego oraz szeroka dostępność i niskie koszty. Metoda bazuje na zastosowaniu środka kontrastowego specyficznie wiążącego się z określonymi cząsteczkami w tkankach zmienionych chorobowo. Wiązanie to jest możliwe dzięki sprzężeniu podstawowego składnika kontrastu z ligndami o wysokim powinowactwie do tkanek jak przeciwciała czy małe peptydy. Technika ma pozwolić między innymi na wczesne uwidocznienie miażdżycy i zmian nowotworowych. Może też być zastosowana do monitorowana efektów terapii np. lekami hamującymi angiogenezę [2]
Środki kontrastowe
Dwie grupy środków kontrastowych mają znaleźć zastosowanie w omawianej technice: o budowie mikrobańki (stosowane najczęściej) i o budowie innej niż mikrobańka [3]. Te pierwsze to powstałe na bazie emulsji typu gaz - woda pęcherzyki o średnicy 1-4 mikronów. Powietrzny rdzeń pęcherzyka dzięki swojej wysokiej echogeniczności ma zapewnić duży kontrast między pęcherzykami a tłem, natomiast płynna otoczka ma chronić przed rozpadem lub agregacją baniek. Gazowy rdzeń pęcherzyków stanowią gazy o dużej masie cząsteczkowej (tetrafluorek węgla, sześciofluorek siarki, azot), a otoczki zbudowane z albumin, galaktozy, tłuszczów lub polimerów i dodatkowo wzmocnione polietyloglikolem [4,5]. Po podaniu dożylnym mikrobańki dzięki swoim rozmiarom utrzymują się w naczyniu, co ogranicza ich zastosowanie do patologii dotyczących właśnie ścian naczyń (blaszki miażdżycowe, skrzepliny, naciekający nowotwór). Czas półtrwania mikrobaniek wynosi kilka minut.
Środki kontrastowe o budowie innej niż mikrobańka to koloidy o cząsteczkach wielkości 10 do 1000 nanometrów. W przeciwieństwie do mikrobaniek mogą przenikać poza łożysko naczyniowe, jednak ze względu na brak rdzenia powietrznego są trudne do uwidocznienia. Aby ułatwić ich zobrazowanie zaprojektowano mikrocząsteczki w postaci echogenicznych liposomów, mikrokropelek emusji z tetrafluorkiem węgla (perfluorocarbon-PFC), nanobaniek lub nanocząsteczek ciał stałych. Celowane liposomy zastosowano już do uwidocznienia blaszek miażdżycowych w modelach zwierzęcych [6,7]. Nanobańki przenikające poza łożysko naczyniowe i łączące się w tkankach w większe struktury zostały natomiast z powodzeniem wykorzystane do dystrybucji doxorubicyny do tkanek nowotworowych [8]. Jak jednak wspomniano najdalej posunięte są badania nad środkami w postaci mikrobaniek i ich zastosowaniu poświęcona jest pozostała część artykułu.
Celowanie mikrobaniek
Celowanie mikrobaniek może odbywać się w sposób bierny lub aktywny. Sposób bierny to niespecyficzne gromadzenie się środka kontrastowego w miejscu przeznaczenia. Przykładem może być bierne celowanie za pomocą leukocytów aktywowanych przez wprowadzenie do ich błon komórkowych negatywnie naładowanej fosfatydyloseryny. Tak przygotowane leukocyty po zaabsorbowaniu podanego dożylnie kontrastu gromadzą się w miejscu zapalenia i umożliwiają jego uwidocznienie [9]. Z kolei aktywne celowanie polega na odpowiednim przygotowaniu cząsteczek kontrastu. Badania rozpoczęto od prób włączania w otoczkę mikrobaniek awidyny i streptawidyny wiążących biotynę. Te doświadczenia nie znajdą jednak zastosowania w praktyce klinicznej ze względu na występowanie biotyny w wielu zdrowych ludzkich tkankach [10,11]. Inne rozwiązanie polega na wprowadzeniu do otoczek mikrobaniek reszt karboksylowych wiążących reszty lizynowe ligandów (utrudnienie stanowi konieczność dodania bardzo dużych ilości reszt karboksylowych) czy reszt maleinianowych reagujących z resztami tiolowymi ligandów. Pomysłem mającym znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej jest dodanie ligandu do składnika otoczki i spowodowanie tworzenia się baniek po aktywowaniu tych substancji w toku innej reakcji [10,12,13].
Uzyskiwanie obrazu
Celem obrazowania jest rozróżnienie sygnałów: emitowanego przez gromadzące się mikrobańki od sygnału innych tkanek czyli tła (contrast-to-tissue-ratio - CTR). Początkowe próby polegały na niszczeniu niecelowanych mikrobaniek w miejscu ich agregacji (technika Los of Correlation- LOC), co powodowało zmiany sygnału i mogło być zarejestrowane w technice Power Doppler. Ograniczeniem okazał się bardzo krótki czas rozpadu mikrobaniek [14]. Później pojawiła się technika Harmonic Imaging bazująca na zatrzymaniu przez odpowiednie filtry określonych składowych sygnału (harmonicznych). Dzięki niej możliwe stało się odróżnienie nieliniowego sygnału emitowanego przez bańki chaotycznie poruszające się w polu fal ultradźwiękowych od sygnału tła i uzyskanie wyraźniejszego obrazu niż w technice LOC [15]. Filtrowanie oparte na długości fali nie rozróżnia jednak sygnału liniowego od nieliniowego przy dużych długościach fal, co w pewnym stopniu ogranicza metodę. Rozwiązanie mogłoby stanowić nie stosowanie fal o dużych długościach, jednak ograniczyłoby to możliwą do uzyskania rozdzielczość obrazu.
Obecne metody obrazowania polegają na opracowaniu wielu impulsów sygnału emitowanego przez kontrast i analizę tylko jego określonych amplitud lub faz. Poprzez wyeliminowanie pozostałych możliwe staje się uwidocznienie kontrastu na tle tła. Ponieważ filtrowanie nie dotyczy tutaj długości fali, nie ma już ograniczenia co do długości fal. Najprostsze metody bazują na opracowaniu dwóch impulsów. Obecnie są to stosowane techniki: odwrócenia impulsu (Pulse Inversion-PI) i modulacji amplitudy (Amplitude Modulation -AM) oraz kombinacja obu tych technik (PIAM) [16,17].
Dla uzyskania zadowalającego obrazu niezbędne jest zastosowanie fal o częstotliwościach około 20-70 MHz, co pozwoli oceniać obraz w rozdzielczości 20-80 μm. Dla porównania we współcześnie stosowanych aparatach wykorzystywane są fale o częstotliwościach 1-15 MHz (rozdzielczość 100-1500 μm). Trwające od lat prace nad udoskonaleniem aparatury zostały niedawno uwieńczone sukcesem w postaci skonstruowania aparatu o rozdzielczości 18-24 MHz [18].
Ilościowa ocena uzyskanego sygnału
Intensywność sygnału jest proporcjonalna do ilości kontrastu podanego w formie mikrobaniek [19]. Można dokonać ich bezpośredniego lub pośredniego zliczenia. Ta pierwsza metoda jest bardzo trudna i posiada wiele ograniczeń, dlatego też nie znalazła zastosowania. Dużo bardziej przydatne okazało się określenie względnej ilości mikrobaniek w danej lokalizacji. Polega ono na określeniu intensywności sygnału z tkanki zdrowej i zmienionej patologicznie, a uzyskany stosunek tych wartości może posłużyć do obserwacji zmian występowania określonych cząsteczek w czasie.
Zastosowanie kliniczne molekularnego usg
Jako że mikrobańki ze względu na swoje rozmiary nie przekraczają łożyska naczyniowego stają się dogodnym narzędziem do uwidocznienia takich procesów jak angiogeneza, zapalenie czy powstawanie skrzepliny. Środek kontrastowy znakowany w kierunku takich cząsteczek jak VEGFR2, integryna αvβ3 czy endoglina był już z powodzeniem zastosowany do uwidocznienia i oceny angiogenezy w raku sutka [20]. Wyznakowanie mikrobaniek jednocześnie przeciwko VEGF2 i integrynie αvβ3 spowodowało znaczne wzmocnienie sygnału ognisk raka jajnika wszczepionego podskórnie u myszy [21]. Stwarza to możliwość zastosowania podwójnie znakowanych mikrobaniek we wczesnym wykrywaniu nowotworów wykazujących ekspresję różnych cząsteczek na różnych etapach rozwoju. Podobnie udowodniono, że technika molekularnego usg może być przydatna w monitorowaniu efektów terapii skierowanej przeciw angiogenezie. W próbie na zwierzętach przeciw komórkom raka trzustki w czasie leczenia anty-VEGF i/lub gemcytabiną skierowano mikrobańki wyznakowane dla kompleksu VEGF2 lub VEGF-VEGFR albo endogliny. Uzyskano osłabienie sygnału i zarejestrowano zmniejszenie gęstości unaczynienia w obrębie guzów poddanych terapii. W innym badaniu dokonano oceny gęstości ekspresji cząsteczek VEGF2 w komórkach raka okrężnicy wszczepionego myszy. Po 24 godzinach od wdrożenia leczenia anty-VEGF zarejestrowano zmniejszenie sygnału, podczas gdy unaczynienie guza pozostało nie zmienione. Może to czynić cząsteczkowe usg narzędziem do bardzo wczesnej oceny terapii przeciw angiogenezie nowotworowej [13].
Dla oceny składowej zapalnej w powstawaniu miażdżycy wykorzystano ostatnio mikrobańki wyznakowane jednocześnie przeciwko cząsteczkom VCAM1 i selektynie-P. Podobnie posłużono się mikrobańkami celowanymi dla selektyny-P dla określenia obszaru reperfuzji nieobjętego martwicą po ostrym niedokrwieniu mięśnia sercowego [22] i obszaru, którego niedawno dotyczyło niedokrwienie [24]. Stwarza to perspektywę wykorzystania cząsteczkowego usg jako szybkiego narzędzia do diagnostyki pacjentów z nietypowym bólem w klatce piersiowej. Omawiane zastosowanie można też poszerzyć o diagnostykę zapalenia mięśnia sercowego i wykrywanie rozpoczynającego się odrzucenia przeszczepu serca. Identyfikacja zapalenia może okazać się użyteczna również w ocenie nasilenia procesu w chorobach zapalnych jelit. Niedawno z powodzeniem posłużono się w tym celu kontrastem przeciwko związanym z tym procesem cząsteczkom MAdCAM1 [23].
Ogromne znaczenie może mieć wykorzystanie cząsteczkowego usg w uwidacznianiu powstających skrzeplin. Ponadto można by wykorzystać rozbijanie mikrobaniek ultrafalami do niszczenia tych zmian. Badania dotyczące tych zastosowań pozostają ciągle w fazie początkowej, mimo, że udało się udowodnić na modelach zwierzęcych wiązanie mikrobaniek skierowanych na GP IIb/IIIa do skrzeplin obecnych zarówno w żyłach jak i w tętnicach [25,26].
Możliwe kierunki rozwoju
Wykorzystanie fal o dwóch różnych częstotliwościach. Fala o mniejszej częstotliwości wprawiałaby mikrobańki w drgania, podczas gdy ta o większej częstotliwości służyłaby do rejestracji sygnału. Technika ta określana jako SURF (Second Order UltRasound Field Imaging) została już wykorzystana w klasycznym usg do obrazowania jamy brzusznej i gruczołu krokowego [27,28].
Wprowadzenie metod różnicowania mikrobaniek związanych z epitopem od krążących. Pierwsza z nich bazuje na założeniu, że związane mikrobańki rozpadają się dużo szybciej niż te krążące. Dzięki potencjalnym ultraszybkim metodom rejestracji obrazu ta różnica rzędu 20-30 ms może zostać uchwycona i pozwolić na zróżnicowanie obszarów zawierających związane lub krążące mikrobańki [29]. Inna w uproszczeniu zakłada wyizolowanie sygnału ze wszystkich mikrobaniek od tła i ich rozróżnianie za pomocą metody dopplerowskiej baniek ruchomych od nieruchomych [30].
Obrazowanie 3D może okazać się szczególnie istotne w obrazowaniu wzrostu guzów nowotworowych. Z pewnością przydatne okażą się doświadczenia z klinicznie już stosowanym real-time-imaging.
Obecne zastosowanie kliniczne
Współcześnie niecelowane mikrobańki są z powodzeniem wykorzystywane jako środek kontrastowy do obrazowania zmian ogniskowych w miąższowych narządach jamy brzusznej zwłaszcza w wątrobie oraz do oceny unaczynienia mózgowia, nerek i systemu żyły wrotnej. Ponadto były przydatne w badaniach naukowych dotyczących endokardium i miokardium. Natomiast środki kontrastowe w postaci celowanych mikrobaniek pozostają na etapie badań przedklinicznych.
Wnioski
Molekularne usg jest nową obiecującą metodą obrazowania. Jej dalszy rozwój prawdopodobnie będzie możliwy dzięki udoskonalaniu aparatury do diagnostyki ultrasonograficznej oraz dalszym badaniom nad udoskonaleniem środków kontrastowych.
Bibliografia
1. Deshpande N, Needles A, Willmann JK.. Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Clin Radiol 2010 Jul;65(7):567-81. 2. [1] Willmann JK, van Bruggen N, Dinkelborg LM, Gambhir SS.The Molecular Imaging Program at Stanford, Department of Radiology and Bio-X Program, Stanford University School of Medicine, Stanford, California 94305-5427, USA.Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 2008 Jul;7(7):591-607. 3. [2] Lanza GM, Wickline SA Targeted ultrasonic contrast agents for molecular imaging and therapy.. Curr Probl Cardiol. 2003 Dec;28(12):625-53. 4. [3] Klibanov AL. University of Virginia Medical Center, Cardiovascular Division, Charlottesville, VA 22908, USA. Molecular imaging with targeted ultrasound contrast microbubbles. Ernst Schering Res Found Workshop. 2005;(49):171-91. 5. [4] McCulloch M, Gresser C, Moos S, Odabashian J, Jasper S, Bednarz J, Burgess P, Carney D, Moore V, Sisk E, Waggoner A, Witt S, Adams D.University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA.Ultrasound contrast physics: A series on contrast echocardiography, article 3. J Am Soc Echocardiogr. 2000 Oct;13(10):959-67. 6.[10]. Hamilton AJ, Huang SL, Warnick D, Rabbat M, Kane B, Nagaraj A, Klegerman M, McPherson DD. J Intravascular ultrasound molecular imaging of atheroma components in vivo. Am Coll Cardiol. 2004 Feb 4;43(3):453-60. 7.[11] Lanza GM, Wallace KD, Scott MJ, Cacheris WP, Abendschein DR, Christy DH, Sharkey AM, Miller JG, Gaffney PJ, Wickline SA. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 1996 Dec 15;94(12):3334-40. Erratum in: Circulation 1997 May 20;95(10):2458. 8. [15] Rapoport N, Gao Z, Kennedy A.J Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Natl Cancer Inst. 2007 Jul 18;99(14):1095-106. Epub 2007 Jul 10. 9. [20] Lindner JR, Dayton PA, Coggins MP, Ley K, Song J, Ferrara K, Kaul S. Noninvasive imaging of inflammation by ultrasound detection of phagocytosed microbubbles. Circulation. 2000 Aug 1;102(5):531-8. 10. [21] Klibanov AL.Bioconjug Chem Ligand-carrying gas-filled microbubbles: ultrasound contrast agents for targeted molecular imaging.. 2005 Jan-Feb;16(1):9-17. 11.[23] Kaufmann BA. Ultrasound molecular imaging of atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2009 Sep 1;83(4):617-25. Epub 2009 Jun 3. 12.[26] Pochon S, Tardy I, Bussat P, Bettinger T, Brochot J, von Wronski M, Passantino L, Schneider M.Invest BR55: a lipopeptide-based VEGFR2-targeted ultrasound contrast agent for molecular imaging of angiogenesis. Radiol. 2010 Feb;45(2):89-95. 13.[27] Pysz MA, Foygel K, Rosenberg J, Gambhir SS, Schneider M, Willmann JK.Department of Radiology, Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University School of Medicine, 300 Pasteur Dr, Room H1307, Stanford, CA 94305, USA Antiangiogenic cancer therapy: monitoring with molecular US and a clinically translatable contrast agent (BR55). Radiology. 2010 Aug;256(2):519-27. Epub 2010 Jun 1.