CIMG4081

5. Metody    otr,

i oczyszczania

preparatów wirusowych

OTRZYMYWANIE OCZYSZCZONYCH WIRIONÓW

SĄCZENIE I ULTRASĄCZENIE

Płynny materiał zawierający wirusy przesącza się przez różne filtry o zróżnicowanej wielkości porów (porcelanowe, szklane, azbestowe, kolodionowe). Podstawowym warunkiem jest, aby filtry zatrzymywały bakterie.

W takich przesączach mogą być obecne wirusy, ale również obce cząsteczki i sole. Ponadto w procesie sączenia dochodzi do utraty części wirionów, które ulegają adsorpcji na filtrach.

Proces, w którym wykorzystuje się filtry membranowe otrzymywane np. z nitrocelulozy, nazywa się ultrasączeniem (ultrafiltracją). Sączenie przez takie filtry wymaga wspomagającego działania (podwyższonego lub zmniejszonego ciśnienia). Ultrasączenie, przy zastosowaniu filtrów zatrzymujących wirusy o określonej wielkości, może służyć zagęszczeniu preparatu wirusowego.

DIALIZA

W zawiesinie wirusowej jest często wiele cząstek mniejszych od wirusa, w tym pochodzenia komórkowego. Do oddzielenia tych cząstek, m.in. soli, stosuje się dializę. Dializa jest procesem, w którym przez błonę przepuszczającą o określonej średnicy porów dochodzi do wymiany cząstek mniejszych, aż do wyrównania stężeń roztworów z obu stron błony.

WIROWANIE I ULTRAWIROWANłE

Zawiesiny z tkanek i narządów zawierają często wirusy oraz sole i cząstki o różnej wielkości i gęstości. W celu uzyskania czystych wirionów trzeba usunąć wszystkie niepożądane składniki. Jedną z metod jest wirowanie w różnych

środowiskach przy odpowiednich wartościach wirowania (g). W ten sposób można je kolejno osadzać na dnie lub w odpowiednich warstwach. Oczywiście przy dużych wartościach (na ogół 40000-100000 x g) uzyskuje się osad wirusów oraz cząsteczek o takich samych parametrach sedymentacji. A więc nadal uzyskany wirus nie jest całkowicie oczyszczony. Natomiast w płynie ponad takim osadem wirusowym mogą być obecne, oprócz lżejszych związków zanieczyszczających, również fragmenty dezintegrowanych wirusów. Do dalszych procesów oczyszczania można dostosować warianty różnicującego wirowania w różnych środowiskach.

STRĄCANIE

Wytrącanie wirionów polega na stosowaniu niektórych nieorganicznych soli, np. siarczanu amonu albo siarczanu sodu przy nasyceniu roztworu 30—50%. Można też do wytrącania zastosować związki organiczne, zwłaszcza te, które stosuje się do wytrącania białek, jak etanol, metanol, aceton. Najprzydatniejsze jest wytrącanie w temp. 0°C. Ponadto przydatne jest wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG), zwłaszcza polimerem o masie cząsteczkowej 6000, mniej przydatne o masie cząsteczkowej 20 000. Wytrącanie jest intensywne przy sączeniu NaCl 0,01-0,1 mol/1.

Inną metodą wytrącania jest stosowanie punktu izoelektrycznego, charakterystycznego dla danego wirusa, tj. przy takim pH, przy którym wirus traci ładunek elektrostatyczny.

Dla wszystkich metod wytrącania jest jednak typowe, że wraz z wirionami można równocześnie wytrącić cząsteczki białkowe nie pochodzące z wirusów, a zanieczyszczające dany preparat wirusowy. Stężenie tych zanieczyszczeń można jednak zmniejszyć przez optymalizację składników wytrącających (stężenia, łączenia), łączenia metod wytrącania z innymi metodami oczyszczania preparatów wirusowych.

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Do oczyszczania wirusów można zastosować różne odmiany chromatografii kolumnowej. Przy chromatografii adsorpcyjnej wiriony oddzielają się przez naprzemienną adsorpcję i elucję wirusów, w chromatografu jonowej rozdział przeprowadza się na podstawie ładunków elektrostatycznych. W chromatografii żelowej dochodzi do oddzielenia na zasadzie różnic w gęstości molekularnej, przy czym oddziela się element o tej gęstości, który zawiera materiał wirusowy.

Wartościową metodą jest chromatografia powinowactwa (affinitive chroma-tography). Zasada metody polega na tym, że na matrycy kolumny osadzone są określone bioswoiste ciała (tzw. ligandy), które jednak mają wolne aktywne ośrodki, reagujące swoiście, a zarazem odwracalnie z innym związkiem. Swoiście - tzn., że w tym przypadku wiąże określonego wirusa, a odwracalnie oznacza, że zmiana wymienników, np. zmiana pH, powoduje, że związana substanqa (wirus, składnik wirusowy) zostaje uwolniona, a więc eluuje z kolumny. Stosując tę metodę, można uzyskać bardzo dobrze oczyszczony preparat wirusowy.

35