Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych

Naturalne środowiska mikroorganizmów są różnorodne - zasiedlają one wszystkie siedliska w których żyją organizmy wyższe oraz nisze specyficzne dla siebie

Właśnie dlatego mikroorganizmy wyznaczają granicę biosfery.

Są powszechne we wszystkich środowiskach - biorą udział w rozkładzie materii, obiegu pierwiastków, żywotności organizmów…

Niektóre bakterie i archeony zasiedlają ekstremalne środowiska (endospory niektórych bakterii znajdują się nawet na wysokości 28 km, a nawet 11km w głąb Ziemi (bakterie beztlenowe haloficzne)

Szerokie rozprzestrzenienie mikroorganizmów jest możliwe dzięki:

1. ich małym rozmiarom (dlatego mogą zająć nawet najmniejsze siedliska)

2. krótkiemu czasowi generacji -> mogą szybko się dzięki temu namnażać (w postępie geometrycznym)

3. różnorodności metabolicznej (zdolności do wykorzystywania wielu źródeł węgla, azotu, energii, różnych końcowych akceptorów elektronów)

• mikroorganizmy mogą wykorzystywać prawie wszystkie źródła węgla - związki organiczne, nieorganiczne, a nawet sztuczne

• jako źródło azotu wykorzystują sole amonowe, azotany, azot atmosferyczny i związki organiczne

• ostatecznymi akceptorami elektronów może być tlen, związki organiczne lub związki nieorganiczne

Niebieskim kolorem oznaczone są cechy wyłączne dla mikroorganizmów.

4. możliwości przestawienia metabolizmu, np.:

• warunkowe tlenowce -> w warunkach tlenowych przeprowadzają efektywniejsze oddychanie tlenowe, lecz gdy zabraknie tlenu mogą oddychać beztlenowo

• warunkowymi autotrofami -> w razie braku związków organicznych potrafią asymilować CO₂ atmosferyczny

zdolności do życia w warunkach ekstremalnych:

1. temperaturowo:

1. psychrofile - żyjące w temperaturze <15°C

2. termofile - żyjące w temperaturze >45°C

3. hipertemofile - żyjące w temperaturze >80°C

1. pH

• kwasolubne - bakterie występujące np. w żołądku (pH 2) czy bakterie fermentujące

• zasadolubne - np. bakterie żyjące w jeziorach sodowych

1. potencjału oksydacyjnego

2. ciśnienia hydrostatycznego (bardzo dobrze znoszą wysokie ciśnienie, np. obligatoryjno barofilne-> ich nie można wyizolować)

3. osmofile -> ciśnienie osmotyczne

4. oligotrofy -> mogą występować przy bardzo niskich stężeniach substancji pokarmowych

• zdolność do wytwarzania form przetrwalnikowych - endospor, cyst

Każde środowisko ma charakterystyczną florę mikroorganizmów. Jednakże wiele mikroorganizmów może się rozwijać w różnych biotopach.

4 środowiska życia mikroorganizmów:

1. organizmy wyższe

• każdy organizm wyższy ma właściwą dla siebie florę mikroorganizmów

• bardzo częste są symbiozy - bakterie żyją w jamie ustnej, żołądku, jelicie grubym

• podobno człowiek ma więcej komórek mikroorganizów niż swoich własnych

2. powietrze

• jest niedogodne dla rozwoju mikroorganizmów -> jest tam mało biogenów, panuje tam mała wilgotność, duża różnica temperatur (dobowa i sezonowa), a ponadto mikroorganizmy są wystawione na działanie promieni UV

• mimo, że środowisko to jest ubogie to mikroorganizmy znajdują się w nim, np. w formach przetrwanych lub np. na drobinach kurzu

• mróz nie wymraża bakterii, zabija je natomiast promieniowanie UV

• często na wysiewie z powietrza tworzą się barwne kolonie -> dużo bakterii z powietrza posiada karotenoidy - zabezpieczają one bakterie przed promieniowaniem UV i powstawaniem nadtlenków

3. gleba

• w glebie jest największa różnorodność i liczebność mikroorganizmów

• jest środowiskiem nieciągłym w przestrzeni (różnorodność mikrosiedlisk - tu bogato, tam ubogo :P) i czasie (wraz z rozwojem mikroorganizmów zmieniają się warunki środowiska)

• najbardziej bogate w mikroorganizmy jest górne 30 cm gleby - występuje tam ok. 6*10⁸ bakterii w 1 g gleby

• próchnica jest najbardziej bogatą w zw. Organiczne częścią gleby

• bakterie autoktoniczne -> typowe bakterie glebowe, np. promieniowce (wytwarzają geokosminę -nadaje zapach glebie), streptomyces, bakterie śluzowe, azotobakterie

• bakterie alloktoniczne(napływowe) -> do gleby dostają się z innych środowisk

• w 1 gramie gleby bogatej znajduje się 6*10⁸mikroorganizmów, w ubogiej ok. 10⁶

4. woda

• jest środowiskiem ciągłym w przestrzeni (zmiany warunków są stopniowe) i w czasie (zmiana składu wody zachodzi bardzo powoli)

• w czystych wodach źródlanych występują oligotrofy

• w zimnych wodach występują psychrofile

• liczebność bakterii w wodach jest rzędu 10⁴-10⁷ na 1 ml

Mikroorganizmy ze środowisk izolujemy na agarze odżywczym by móc policzyć liczebność bakterii oraz wyizolować czyste kultury

Izolowanie czystych kultur

Morfologia koloni zależy od warunków inkubacji (środowiska)

Metody izolowania czystych kultur:

1. metody bezpośrednie:

• pobranie pojedynczej komórki i umieszczenie jej na jałowym podłożu -> komórkę pobiera się pod mikroskopem za pomocą mikromanipulatora

• metody pośrednie:

• metody płytkowe (używa się podłóż stałych) -> bakterie wysiewamy na płytki z podłożem i otrzymujemy kolonie

• metoda suchych rozcieńczeń (posiew redukcyjny) -> wykonujemy go ezą

• posiew powierzchniowy ->na podłoże na płytce nanosimy 0,1 ml odpowiednio rozcieńczonego środowiska (tak aby znajdowało się tam 30-300 komórek). Następnie płyn rozsmarowujemy głaszczką

• metoda płytek lanych -> siejemy odpowiednio rozcieńczone środowisko na płytkę a następnie zalewamy je schłodzonym podłożem (45°C). W ten sposób wyrosną kolonie wgłębne

• metoda rozcieńczeń Listera -> środowisko rozcieńcza się wielokrotnie. Następnie z ostatnich probówek wysiewa się zawartość by sprawdzić czy są tam mikroorganizmy.

• Metody powietrzne

• Sedymentacja -> powolne opadanie powietrza na podłoże. Przeprowadza się ją określoną ilość czasu by ustalić liczbę mikroorganizmów w powietrzu.

• Nadmuchiwanie -> wpompowywanie na podłoże określonej ilości powietrza

Sposoby pobierania wysiewu:

1. Ezą

2. Głaszczką

3. Wykałaczką

4. Robienie wymazów -> wacik w probówce

5. Stemple do pobierania z powierzchni

Wyniki

Izolowanie drobnoustrojów z powietrza metodą sedymentacji Kocha

Sedymentacja prowadzona była 10 minut

Miejsce sedymentacji	Liczba kolonii
Podłoga	23
Parapet	29
Parapet	20
Półka	25
Średnia-24,25

Obliczanie liczby drobnoustrojów w 10 dm³ powietrza:

X=(a*100)/(b*c)

a - uśredniona liczba kolonii na płytce

b - powierzchnia płytki w cm² (50 cm²)

c - współczynnik czasu (dla 5 minut - 1; dla 10 - 2; dla 15 - 3)

100 - przeliczenie powierzchni płytki na 100 cm²

X=(24,25*100)/(50*2) = 24,25 cfu/10dm³

Cfu - liczba komórek bakteryjnych która dała kolonię (czyli liczba bakterii które wyrosły na płytce)

Izolowanie mikroorganizmów z naturalnego zbiornika wodnego i szacowanie ich liczby

Kolonie na agarze odżywczym:

Rozcieńczenie	Ilość kolonii		Średnia liczba koloni
-1 (10x)	niepoliczalne		Brak
-2 (100x)	402	290	Ok. 350
-3 (1000x)	90	80	85
-4 (10000x)	21	19	20

Każde rozcieńczenie było wysiewane 2 razy

Obliczanie liczby drobnoustrojów w 1 ml wody ze stawu:

Do obliczeń bierzemy te płytki na których wyrosło od 30 do 300.

X=a*b*10

a - średnia liczba bakterii na płytkach

b - odwrotność wysianego rozcieńczenia

10 - przeliczenie na 1 ml (bo wysiewamy 0,1 ml)

Do obliczeń bierzemy rozcieńczenie -3

X = 85*10³*10 = 8,5*10⁵ cfu/ml

W 1 ml wody ze stawu znajduje się 8,5*10⁵ drobnoustrojów

Izolowanie mikroorganizmów z gleby i szacowanie ich liczby

Kolonie wysiewane na agarze odżywczym:

Rozcieńczenie	Średnia liczba kolonii
-2 (100x)	Niepoliczalne
-3 (1000x)	Niepoliczalne
-4 (10000x)	235
-5 (100000x)	20
-6 (1000000x)	7

Obliczanie liczby drobnoustrojów w 1 g gleby:

X=a*b*10

a - średnia liczba bakterii na płytkach

b - odwrotność wysianego rozcieńczenia

10 - przeliczenie na 1 ml (bo wysiewamy 0,1 ml)

X=235*10⁴*10=2,35*10⁷ cfu/g

W 1 g gleby znajduje się 2,35*10⁷ drobnoustrojów, czyli ok. 100 razy więcej niż w wodzie

Kolonie na innych podłożach:

• Podłoże Fiodora - 70 koloni (głównie promieniowce)

• Podłoże Davisa - 74 kolonie

• Agar odżywczy ze streptomycyną - 6 kolonii (wyrosły jedynie bakterie oporne na streptomycynę)

---