IDENTYFIKACJA

MUTACJI METODĄ

SSCP

(Single Strand Conformation

Polymorphism)

SSCP - (single strand conformation
polimorphism) - technika biologii
molekularnej stosowana w
wykrywaniu mutacji. Jest to metoda
badania polimorfizmu
konformacyjnego jednoniciowego
DNA.

Mutacja punktowa – dotyczy nie
wielkiej liczby nukleotydów

Olbrzymi postęp w identyfikacji i klonowaniu genów
odpowiedzialnych za choroby dziedziczne wymagał
rozwoju metod umożliwiających szybkie wykrywanie
i charakterystykę mutacji. Określenie sekwencji
nukleotydów to najbardziej bezpośrednie podejście
do wykrywania mutacji. W przypadkach, gdy
poszukuje się mutacji w dużej grupie chorych nie
korzysta się z tej metody, lecz wybiera się technikę
pozwalającą na wstępne wyselekcjonowanie
zmienionych fragmentów DNA do analizy
sekwencyjnej. Najczęściej stosowanymi metodami
są:

analiza heterodupleksów (HD)

polimorfizm konformacji jednoniciowych DNA
(SSCP)

elektroforeza w gradiencie czynnika
denaturującego (DGGE)

chemiczna lub enzymatyczna analiza
niesparowań.

Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych
fragmentów DNA jest jedną z najczęściej
stosowanych technik elektroforetycznych
umożliwiających wykrywanie punktowych zmian w
DNA. Materiałem wyjściowym do analizy SSCP są
produkty PCR, które przed elektroforezą
denaturuje się termicznie w buforze obciążającym
z dodatkiem czynnika denaturującego mocznika
lub wodorotlenku sodowego. Rozdział
przygotowanych produktów PCR prowadzi się w
natywnym żelu poliakryloamidowym. W
natywnych warunkach elektroforezy jednoniciowa
cząsteczka DNA tworzy wewnętrzne sparowania
przez co przyjmuje określoną konformacje
przestrzenną zależną od sekwencji nukleotydów.
Szybkość migracji jednoniciowych fragmentów
DNA zależy od ich wielkości oraz konformacji.
Fragmenty o tej samej długości i sekwencji
nukleotydów przyjmują takie same konformacje i
wykazują taką samą ruchliwość.

Na czym polega metoda
SSCP ?

Teoretycznie wystarczy zmiana jednego nukleotydu,
aby
fragment przyjął inną konformację i migrował z inną
szybkością. W praktyce technika nie wykrywa
wszystkich zmian sekwencji. Najlepsze wyniki,
ponad 95% wykrywalności zmian osiąga się dla
fragmentów DNA o wielkości 100-300 pz. Dla
odcinków 300-450 pz wykrywalność spada poniżej
80%. Zatem istotna jest długość odcinków.
Na jakość i wydajność tworzenia konformerów
wpływa wiele czynników:
temperatura
stężenie DNA
siła jonowa buforu
usieciowanie żelu i stężenie glicerolu w żelu.
Szczególnie ważnym parametrem jest temperatura
elektroforezy, która nie powinna przekraczać 20˚ C.
Aby uzyskać jak największą wykrywalność zmian,
analiza SSCP każdego fragmentu prowadzi się w
różnych warunkach. Najczęściej stosuje się rozdział
elektroforetyczny w żelu z dodatkiem 5-10%
glicerolu w temperaturze 20˚ C oraz w żelu bez
glicerolu w temperaturze 4˚ C.

Etapy SSCP:

1. Amplifikacja. DNA amplifikowane w reakcji PCR.
Maksymalną skuteczność wykrywania mutacji osiąga się
badając DNA o długości 150-200 nukleotydów.

2. Denaturacja. dsDNA jest denaturowane pod wpływem
silnej zasady lub poprzez połączenie działania
formamidu oraz wysokiej temperatury.

3. Elektroforeza. Zdenaturowane DNA rozdzielane jest
elektroforetycznie w warunkach niedeneturujących.

4. Wykrywanie. Konformery

Doświadczenie 1.

WYKRYWANIE MUTACJI I POLIMORFIZMU DNA METODĄ
SSCP

Celem doświadczenia jest wykrycie zmian w eksonie 6
genu DMD człowieka u chorych na dystrofię mięśni
Duchenne a.

Sekwencje starterów:

DMD6F 5 -CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA-3

DMD6R 5 -GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG-3

Wielkość amplifikowanego fragmentu – 202 pz

Analiza PCR-
SSCP eksonu 6
genu DMD
człowieka.

Tor 1 marker
wielkości, tory
2-12 Dna
chorych na
dystrofię
mięśniową, tor
11 zmieniony
wzór SSCP
wskazuje na
mutację w
eksonie 6 genu
DMD

Doświadczenie 2.

WYKRYWANIE MUTACJI I POLIMORFIZMU DNA METODĄ
SSCP

Celem doświadczenia jest wykrycie zmian w eksonie 11
genu RET człowieka u chorych na raka rdzeniastego
tarczycy.

Sekwencje starterów:

RET11F 5 -Cy5-CATGAGGCAGAGCATACGCA-3

RET11R 5 -GACAGCAGCACCGAGACGAT-3

Wielkość amplifikowanego fragmentu – 161 pz

Analiza PCR-SSCP
eksonu 11 genu RET
człowieka.

Tory 1-6, DNA
chorych na raka
rdzeniastego
tarczycy: tor 3
zmieniony wzór
SSCP wskazuje na
mutację w eksonie
11 genu RET.



Bibliografia

• Piotr Węgleński Genetyka molekularna
• Ryszard Słomski (red.) Analiza DNA teoria i
praktyka.

Strona internetowa:

• www.biotechnolog.pl
• www.pnmedycznych.pl