IDENTYFIKACJA 

MUTACJI METODĄ 

SSCP

(Single Strand Conformation 

Polymorphism)

SSCP - (single strand conformation 
polimorphism) - technika biologii 
molekularnej stosowana w 
wykrywaniu mutacji. Jest to metoda 
badania polimorfizmu 
konformacyjnego jednoniciowego 
DNA. 

Mutacja punktowa – dotyczy nie 
wielkiej liczby nukleotydów

Olbrzymi postęp w identyfikacji i klonowaniu genów 
odpowiedzialnych za choroby dziedziczne wymagał 
rozwoju metod umożliwiających szybkie wykrywanie 
i charakterystykę mutacji. Określenie sekwencji 
nukleotydów to najbardziej bezpośrednie podejście 
do wykrywania mutacji. W przypadkach, gdy 
poszukuje się mutacji w dużej grupie chorych nie 
korzysta się z tej metody, lecz wybiera się technikę 
pozwalającą na wstępne wyselekcjonowanie 
zmienionych fragmentów DNA do analizy 
sekwencyjnej. Najczęściej stosowanymi metodami 
są: 

         analiza heterodupleksów (HD)

         polimorfizm konformacji jednoniciowych DNA 
(SSCP)

         elektroforeza w gradiencie czynnika 
denaturującego (DGGE)      

         chemiczna lub enzymatyczna analiza 
niesparowań. 

Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych 
fragmentów DNA jest jedną z najczęściej 
stosowanych technik elektroforetycznych 
umożliwiających wykrywanie punktowych zmian w 
DNA. Materiałem wyjściowym do analizy SSCP są 
produkty PCR, które przed elektroforezą 
denaturuje się termicznie w buforze obciążającym 
z dodatkiem czynnika denaturującego mocznika 
lub wodorotlenku sodowego. Rozdział 
przygotowanych produktów PCR prowadzi się w 
natywnym żelu poliakryloamidowym. W 
natywnych warunkach elektroforezy jednoniciowa 
cząsteczka DNA tworzy wewnętrzne sparowania 
przez co przyjmuje określoną konformacje 
przestrzenną zależną od sekwencji nukleotydów. 
Szybkość migracji jednoniciowych fragmentów 
DNA zależy od ich wielkości oraz konformacji. 
Fragmenty o tej samej długości i sekwencji 
nukleotydów przyjmują takie same konformacje i 
wykazują taką samą ruchliwość. 

Na czym polega metoda 
SSCP ?

Teoretycznie wystarczy zmiana jednego nukleotydu, 
aby
fragment przyjął inną konformację i migrował z inną 
szybkością. W praktyce technika nie wykrywa 
wszystkich zmian sekwencji. Najlepsze wyniki, 
ponad 95% wykrywalności zmian osiąga się dla 
fragmentów DNA o wielkości 100-300 pz. Dla 
odcinków 300-450 pz wykrywalność spada poniżej 
80%. Zatem istotna jest długość odcinków.
Na jakość i wydajność tworzenia konformerów 
wpływa wiele czynników:
        temperatura
        stężenie DNA
        siła jonowa buforu
        usieciowanie żelu i stężenie glicerolu w żelu.
Szczególnie ważnym parametrem jest temperatura 
elektroforezy, która nie powinna przekraczać 20˚ C. 
Aby uzyskać jak największą wykrywalność zmian, 
analiza SSCP każdego fragmentu prowadzi się w 
różnych warunkach. Najczęściej stosuje się rozdział 
elektroforetyczny w żelu z dodatkiem 5-10% 
glicerolu w temperaturze 20˚ C oraz w żelu bez 
glicerolu w temperaturze 4˚ C. 

Etapy SSCP:

1. Amplifikacja. DNA amplifikowane w reakcji PCR. 
Maksymalną skuteczność wykrywania mutacji osiąga się 
badając DNA o długości 150-200 nukleotydów. 

2. Denaturacja. dsDNA jest denaturowane pod wpływem 
silnej zasady lub poprzez połączenie działania 
formamidu oraz wysokiej temperatury.

3. Elektroforeza. Zdenaturowane DNA rozdzielane jest 
elektroforetycznie w warunkach niedeneturujących. 

4. Wykrywanie. Konformery 

Doświadczenie 1.

WYKRYWANIE MUTACJI I POLIMORFIZMU DNA METODĄ 
SSCP

Celem doświadczenia jest wykrycie zmian w eksonie 6 
genu DMD człowieka u chorych na dystrofię mięśni 
Duchenne   a.

Sekwencje starterów:

DMD6F 5  -CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA-3  

DMD6R 5  -GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG-3  

Wielkość amplifikowanego fragmentu – 202 pz

Analiza PCR-
SSCP eksonu 6 
genu DMD 
człowieka.

Tor 1 marker 
wielkości, tory 
2-12 Dna 
chorych na 
dystrofię 
mięśniową, tor 
11 zmieniony 
wzór SSCP 
wskazuje na 
mutację w 
eksonie 6 genu 
DMD

Doświadczenie 2.

WYKRYWANIE MUTACJI I POLIMORFIZMU DNA METODĄ 
SSCP

Celem doświadczenia jest wykrycie zmian w eksonie 11 
genu RET człowieka u chorych na raka rdzeniastego 
tarczycy.

Sekwencje starterów:

RET11F 5  -Cy5-CATGAGGCAGAGCATACGCA-3  

RET11R 5  -GACAGCAGCACCGAGACGAT-3  

Wielkość amplifikowanego fragmentu – 161 pz

Analiza PCR-SSCP 
eksonu 11 genu RET 
człowieka.     

Tory 1-6, DNA 
chorych na raka 
rdzeniastego  
tarczycy: tor 3 
zmieniony wzór 
SSCP wskazuje na 
mutację w eksonie 
11 genu RET.



Bibliografia

• Piotr Węgleński Genetyka molekularna
• Ryszard Słomski (red.) Analiza DNA teoria i 
praktyka.

Strona internetowa:

• www.biotechnolog.pl 
• www.pnmedycznych.pl