Higiena produkcji żywności
Wykład 6
Temat:
KONTROLA SKUTECZNOÅšCI MYCIA I DEZYNFEKCJI
Szybkie metody kontroli
Możliwość szybkiego sprawdzenia poprawności wykonywanej pracy działa mobilizująco na
pracowników produkcyjnych i wykonujących zabiegi mycia i dezynfekcji.
Luminometria
Zasada luminometrii:
W każdej żywej komórce oraz materiałach pochodzenia biologicznego obecny jest
adenozynotrifosforan (ATP).
Podczas hydrolizy ATP do ADP i ortofosforanu lub do AMP i pirofosforanu uwalniana jest
pewna ilość energii swobodnej, którą można zmierzyć jako emisję kwantów światła.
Zjawisko to nosi nazwÄ™ chemiluminescencji, a w przypadku katalizowania jej przez enzym -
bioluminescencji.
Intensywność wydzielanego światła jest proporcjonalna do ilości ATP obecnego w środowisku.
ATP + lucyferyna + lucyferaza + Mg2+
“!
Oksy-lucyferyna + AMP + CO2 + światło
Obecność ATP wskazuje na istnienie zanieczyszczeń organicznych na badanej powierzchni.
Pomiar ATP informuje o ilości obecnego materiału biologicznego poprzez liczbową wartość tzw.
umownych jednostek luminescencyjnych (RLU).
Typowe wartości krytyczne (progowe) określane są indywidualnie dla danego zakładu
i poszczególnych miejsc pomiarowych.
Zalety bioluminescencji:
1. szybkość pomiaru od kilku do kilkudziesięciu sekund,
2. wykonanie analizy poza laboratorium, prawie w każdych warunkach (aparatu są małe,
przenośne),
3. dostępność gotowych zestawów,
4. poręczne narzędzie monitoringu w ramach systemu HACCP - bezpośrednia interpretacja
wartości w danych punkcie pomiaru.
Wady bioluminescencji:
1. Jest testem niespecyficznym, tzn. nie rozróżnia rodzajów materiału biologicznego
2. Wykorzystanie metody do oznaczania zawartości ATP mikrobiologicznego w żywności
wymaga przygotowania próbki, tzn. usunięcia z niej ATP komórek eukariotycznych, które
zawierają nawet do tysiąca razy więcej ATP niż komórki prokariotyczne
Uwaga !!!
W około 5% przypadków oznaczeń, przy niskich odczytach poziomu ATP, w porównywalnych
posiewach metodą płytkową wyrasta stosunkowo duża liczba kolonii.
Może to być to spowodowane obecnością na badanej powierzchni przetrwalników lub spor, które
nie zawierajÄ… ATP i w zwiÄ…zku z tym dajÄ… wynik negatywny
w luminometrze.
Zastosowanie bioluminescencji w praktyce:
1. kontrola czystości powierzchni produkcyjnych, urządzeń i rąk pracowników
2. ocena skuteczności przeprowadzanych procesów mycia - o skuteczności mycia decyduje nie
tylko brak bakterii, ale także brak pozostałości materiału biologicznego
3. badanie mrożonej żywności, soków i napojów
4. badanie wody pitnej
5. ocena procesów fermentacyjnych (browarnictwo, przemysł spirytusowy, mleczarski)
6. kontrola skuteczności środków myjących i dezynfekujących
7. przeprowadzanie szybkiej oceny wzrostu drobnoustrojów oraz badanie wpływu czynników
chemicznych i fizycznych na dynamikę hamowania wzrostu drobnoustrojów
Schemat postępowania przy ocenie stanu higienicznego powierzchni:
Wymaz z badanej powierzchni
“!
Dodatek ekstrahentu
(który powoduje lizę komórek i ułatwia wydzielenie na zewnątrz ATP)
“!
Dodatek kompleksu lucyferyna-lucyferaza
“!
Odczyt wyniku
Oparte na luminometrii:
1. AccuPoint
2. Biotrace Uni-Lite XCEL
3. Charm Lum-T / Firefly
4. BioControl Lightning MVP
Inne nowoczesne metody
VERIcleen (oferta firmy Bentley Polska):
Szybki test do oceny umycia, czuły na pozostałości żywności.
Zanieczyszczona powierzchnia powoduje zabarwienie paska na różowo po 10-60s.
Jest czuły na obecność cukru, ale nie białka.
HY-RiSE® Colour Hygiene Test Strip (oferta firmy MERCK):
To wskaz
nik czystości powierzchni, wykrywa resztki żywności.
HY-RiSE® Colour Hygiene Test Strip:
Jest czuły na obecność NAD, NADH, NADP, NADPH.
JeÅ›li sÄ… one obecne, Glukono-DH® przeksztaÅ‚ca ²-D-glukozÄ™ w D-glukonolakton, który potem
jest przemieniany w barwny zwiÄ…zek.
5. dodać po 1 kropli Reagentów B i C
Inne testy oparte na wykrywaniu cukrów prostych:
1. Pro-Tect (cukry redukujÄ…ce)
2. Spot check (glukoza)
3. Spot check+ (glukoza / laktoza)
Inne testy oparte na wykrywaniu białek:
1. Pro-Tect (Biotrace)
2. Flash (BioControl)
Testy ELISA
Testy oparte na reakcjach immunologicznych.
Dwa rodzaje testów:
1. SANDWICH ELISA
2. COMPETITIVE ELISA
Porównanie metod:
1. ATP  szybki wynik, ogólna informacja
2. Testy na cukry / białka - 10 minut, bardziej specyficzne
3. Testy na alergeny - 10-60 minut, bardziej specyficzne, dotyczą wybranych białek
4. Posiewy agarowe - 24-72 godzin, bardziej specyficzne, dotyczÄ… wybranych
mikroorganizmów
Bezpośrednia epifluorescencja (DEFT)
Jest to stosunkowo szybka (25 - 30 minut) i czuła metoda stosowana do określania liczby
drobnoustrojów: bakterii, pleśni i drożdży, zarówno żywych jak i martwych.
Jest od dawna stosowana do badania mleka surowego (aparat BACTOSCAN).
Wykorzystuje się w niej liczenie komórek za pomocą mikroskopu.
Schemat badania:
ëð trawienie trypsynÄ…
ëð filtracja przez filtr membranowy poliwÄ™glanowy i barwienie oranżem akrydynowym (ten
fluorescencyjny barwnik ma silne powinowactwo do jąder komórkowych
mikroorganizmów, tworzenie kompleksów z DNA i RNA)
ëð uzyskanie zabarwienia - żywe komórki fluoryzujÄ… pomaraÅ„czowo do czerwonego, martwe -
zielono
ëð badanie powierzchni filtra pod mikroskopem fluorescencyjnym
Bezpośrednie barwienie komórek za pomocą INT
Oparta jest na barwieniu przyżyciowym komórek drobnoustrojów z wykorzystaniem chlorku
2-p-jodofenylo-5-fenylo-tetrazolu (INT) i oznaczeniu jego zawartości na podstawie
powstania czarno-fioletowych kryształów formazanu wewnątrz komórek aktywnych
metabolicznie.
Do przeprowadzenia badań jest wymagany barwnik INT, mikroskop oraz aparatura do
przeprowadzenia filtracji membranowej.
Czas testu wynosi około 15 minut.
Biochipy (chipy DNA, sondy DNA)
Zawierają oligonukleotydy odpowiadające tysiącom genów
Zasada metody z zastosowaniem sondy DNA polega na wykorzystaniu jej właściwości do
przyłączania się do komplementarnych fragmentów DNA występujących w komórkach
drobnoustrojów.
Wystarczy znalez
ć specyficzną dla danego mikroorganizmu sekwencję nukleotydów
i otrzymać komplementarną sondę.
1. metoda o bardzo dużej dokładności i czułości.
2. metoda bardzo specyficzna, gdyż obecność drobnoustrojów oznaczana jest na podstawie
ich cech genotypowych, co decyduje o dużej wybiórczości testu
Średnica pojedynczej sondy DNA nie przekracza 200 mikronów, zaś na 1 cm2 płytki może
znajdować się ponad 10 tysięcy sond.
Trwają prace nad zastosowaniem w toksykologii i badaniu jakości mikrobiologicznej wody.
To ostatnie zastosowanie ma za zadanie wykrywać jednocześnie i z niezwykłą czułością
wszystkie spodziewane drobnoustroje chorobotwórcze podczas jednego badania próbki
wody.
Pozwoli to na oszczędność czasu i skrócenie procedury badawczej z 4 dni do około 4 godzin.
Byłaby to jednocześnie analiza jakościowa i ilościowa skażeń mikrobiologicznych wody.
1. NUTRIChip: badanie mikroflory, białek
2. GMOChip: badanie GMO
Skuteczność dezynfekcji
1. Prawidłowo wykonana dezynfekcja powoduje redukcję liczby drobnoustrojów o 5 cykli
logarytmicznych.
2. Dla porównania - prawidłowy proces mycia zmniejsza liczbę drobnoustrojów o ok. 3
cykle logarytmiczne (np. z poziomu 106 do wartości 103 j.t.k.).
Po dezynfekcji nie może być drobnoustrojów chorobotwórczych !
Przy badaniu skuteczności dezynfekcji badanie powierzchni przeprowadza się przed i po zabiegu
dezynfekcji:
Zadowalająca czystość mikrobiologiczna powierzchni metodą szablonową:
1. brak bakterii Enterobacteriaceae
2. liczba drobnoustrojów ogółem < 50 j.t.k. na 1 cm2 powierzchni
Zadowalająca czystość mikrobiologiczna opakowań metodą popłuczyn:
1. brak bakterii Enterobacteriaceae w 1 cm3 popłuczyn
Kontrola czystości rąk pracowników
1. metody mikrobiologiczne tradycyjne: posiewy z popłuczyn, metody odciskowe
2. pomiar ATP
3. zmywka jałowym tamponem wewnętrznej powierzchni dłoni (między palcami także) -
osobno każdą rękę kontrolowanego pracownika
4. wypłukanie obydwu tamponów w 25 cm3 rozcieńczalnika mikrobiologicznego (np.
płynu Ringera)
5. posiew popłuczyn do pożywek dla drobnoustrojów ogółem i Enterobacteriaceae
6. po inkubacji płytek, liczbę mikroflory przeliczyć na 25 cm3 rozcieńczalnika
Nowe regulacje prawne:
1. rozporzÄ…dzenie UE nr 852/2004
2. rozporzÄ…dzenie UE nr 853/2004
Oba obowiÄ…zujÄ… od 1 stycznia 2006 roku !!!
1. ustawa o bezpieczeństwie żywności i żywienia
Inne testy ułatwiające kontrolę w zakładzie
Kontrola fosfatazy:
A Charm Lite Series Test (oferta firmy Bentley):
THE CHEF (Cooking Heat EFficiency) - kontrola skuteczności ugotowania mięsa oraz reinfekcji
opiera się na ocenie aktywności enzymu fosfatazy, powszechnie występującego w tkankach
mięsnych, drobiowych, rybnych, owoców morza.
Fosfataza jest aktywna w mięsie surowym lub poddanym obróbce termicznej nie przekraczającej
63-75°C, lub w miÄ™sie zanieczyszczonym po prawidÅ‚owo wykonanej obróbce termicznej.
Aktywność katalazy:
Może być skutecznie stosowany do kontroli procesów technologicznych, w których
wykorzystywany jest system HACCP i gdzie zagrożeniem są drobnoustroje
katalazo-dodatnie.
Test ten od dawna służy do oceny skuteczności blanszowania warzyw. Użyteczny jest także do
ujawniania początkowych, nieznacznych zakażeń mikrobiologicznych (głównie w
mleczarstwie - do wykrywania w mleku surowym drobnoustrojów i leukocytów).
Wskaz
niki laboratoryjne:
Sterikon® plus Bioindicator (firmy MERCK):
Test umożliwiający kontrolę biologiczną procesu sterylizacji parowej w autoklawie.
Fiolki testu zawierają zawiesinę przetrwalników Bacillus stearothermophilus.
Taśmy do kontroli sterylizacji (firmy MERCK):
Są to samoprzylepne taśmy służące do kontroli sterylizacji.
Zawierają termoczuły barwnik, który w temperaturze 121oC i 134oC zmienia kolor z białawego
na brÄ…zowy.