Ćwiczenie nr 7

dr Mariola Krawiecka

Aminokwasy i białka

Repetytorium

1. Podział aminokwasów.

2. Właściwości aminokwasów-aminokwasy, jako jony obojnacze.

3. Biologicznie ważne peptydy.

4. Leki o budowie aminokwasowej.

5. Struktura, podział i właściwości białek.

6. Biomedyczne znaczenie białek.

7. Trawienie i wchłanianie białek.

8. Choroby związane z zaburzeniami przemiany aminokwasów i białek.

9. Chromatografia bibułowa.

Część praktyczna

1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów.

2. Wytrącanie, wysalanie białek.

3. Identyfikacja dwóch aminokwasów.

4. Chromatografia bibułowa aminokwasów.

Repetytorium

Aminokwasami nazywamy związki zawierające w swej cząsteczce dwie charakterystyczne grupy funkcyjne: aminową - NH₂ i karboksylową - COOH.

Aminokwasy są najmniejszymi elementami strukturalnymi białek, polipeptydów i peptydów we wszystkich organizmach żywych, od bakterii do człowieka tak, więc najważniejszą reakcją aminokwasów, z punktu widzenia biochemicznego, jest reakcja tworzenia wiązania peptydowego (amidowego). Reakcja ta nie przebiega jednak łatwo, gdyż stała równowagi przesunięta jest w kierunku hydrolizy wiązania peptydowego. Aby przeprowadzić syntezę wiązania peptydowego, jedna z grup karboksylowych musi być zaktywowana. Jednym ze sposobów laboratoryjnych jest przeprowadzenie grupy karboksylowej w chlorek kwasowy i kondensacja otrzymanego chlorku z grupą aminową drugiego aminokwasu. W przyrodzie aktywacja grupy karboksylowej zachodzi w wyniku kondensacji z ATP (powstaje aminoacyloadeninan) i następnie zachodzi kondensacja z grupą aminową drugiego aminokwasu.

Powstające wiązanie peptydowe jest planarne (płaskie). Dzięki stabilizacji rezonansowej ma częściowo charakter wiązania podwójnego, zatem zahamowana jest swobodna rotacja wokół wiązania C-N i występuje izomeria cis-trans. Trans- konfiguracja jest korzystniejsza energetycznie niż cis-konfiguracja i częściej występuje w łańcuchach peptydowych.

Usztywnienie wiązania peptydowego wpływa na kształtowanie struktury białek.

Aminokwasy występujące w białkach są kwasami aminokarboksylowymi o konfiguracji L. Wszystkie z wyjątkiem glicyny są czynne optycznie. Oprócz aminokwasów budujących białka istnieje oczywiście cała gama aminokwasów niebiałkowych, które odgrywają ważną rolę w wielu procesach biochemicznych zachodzących w żywych organizmach. Mogą być substratami w utlenianiu komórkowym, w syntezie różnorodnych związków biologicznie czynnych. Aminokwasy lub ich pochodne są neuroprzekaźnikami, neurohormonami lub klasycznymi hormonami.

Aminokwasy, zatem spełniają następujące funkcje:

1) tworzenie białek- rola strukturalna, hormonalna i katalityczna,

2) uczestnictwo w różnorodnych funkcjach wewnątrzkomórkowych jak: przenoszenie impulsów w układzie nerwowym, regulacja wzrostu komórkowego, biosynteza porfiryn, puryn, pirymidyn i mocznika,

3) biosynteza antybiotyków polipeptydowych i substancji przeciwnowotworowych.

Istnieje około 20 podstawowych aminokwasów budujących białka. Wszystkie one posiadają własne kodony genetyczne warunkujące wbudowanie ich w łańcuch polipeptydowy. Olbrzymia różnorodność kombinacji połączeń aminokwasów warunkuje istnienie wielu białek, które to determinują olbrzymią ilość gatunków. Niewielka zmiana w kolejności połączenia aminokwasów powoduje zmiany w funkcji białka, stąd też olbrzymie zainteresowanie budową białek i możliwościami badania ich struktury. Aby określić kolejność aminokwasów stosuje się metody chemiczne:

1. Określenie rodzaju aminokwasów i ich ilości - hydroliza białka (kwasowa, zasadowa lub najczęściej enzymatyczna)

2. Częściowa hydroliza białka na peptydy i następnie:

a) oznaczanie N-końcowego aminokwasu,

b) oznaczanie C-końcowego aminokwasu.

3. Oznaczenie sekwencji aminokwasów

1. Podział aminokwasów

Ze względu na budowę łańcucha R aminokwasy zostały podzielone na siedem grup:

1. Aminokwasy alifatyczne obojętne: glicyna (Gly), alanina (Ala), walina (Val), leucyna (Leu), izoleucyna (Ile)

2. Aminokwasy alifatyczne- hydroksyaminokwasy: seryna (Ser), treonina (Thr)

3. Aminokwasy zawierające siarkę: cysteina (Cys), cystyna (Cys-Cys), metionina (Met)

4. Iminokwasy: prolina (Pro), hydroksyprolina (Hyp)

5. Aminokwasy zasadowe: lizyna (Lys), hydroksylizyna (Hyl), arginina (Arg), histydyna (His)

6. Aminokwasy kwaśne i ich monoamidy: kwas asparaginowy (Asp), asparagina (Asn), kwas glutaminowy (Glu), glutamina (Gln)

7. Aminokwasy aromatyczne i heteroaromatyczne: fenyloalanina (Phe), tyrozyna (Tyr), tryptofan (Trp)

Natura łańcuchów bocznych jest odpowiedzialna za właściwości fizykochemiczne aminokwasów stąd też dzielimy aminokwasy na

1. Aminokwasy hydrofobowe

2. Aminokwasy polarne

A). Obdarzone ładunkiem

B) . Pozbawione ładunku

Ze względu na zapotrzebowanie aminokwasów przez organizm zwierzęcy aminokwasy można podzielić na:

Aminokwasy egzogenne - niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu zwierzęcego, ale niewytwarzane przez ten organizm. Muszą być dostarczane  z zewnątrz wraz z pokarmem.

Dla organizmu człowieka są to: walina, leucyna, izoleucyna, lizyna, fenyloalanina, metionina, treonina, tryptofan, arginina, histydyna (niezbędna dla dzieci do 12 lat).

Aminokwasy endogenne - niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu i wytwarzane przez ten organizm.

Dla organizmu człowieka są to: glicyna, alanina, seryna, cysteina, tyrozyna, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, hydroksyprolina, asparagina, glutamina, prolina.

Bardzo ważny dla prawidłowego funkcjonowania organizmu jest odpowiedni dobór diety bogatej w aminokwasy egzogenne, jeśli zabraknie, choć jednego aminokwasu egzogennego pozostałe aminokwasy, choć dostarczane w odpowiedniej ilości, nie są całkowicie wykorzystywane przez organizm. Mówiąc o odpowiedniej diecie mamy oczywiście na myśli dobór odpowiedniej diety białkowej, gdyż to białka są dla organizmu głównym źródłem aminokwasów.

Nadmierne zaś ilości białek, a zatem i aminokwasów, w odróżnieniu od lipidów i cukrów, nie są magazynowane. Aminokwasy, które nie zostały bezpośrednio wbudowane w białko ulegają dezaminacji. Azot zostaje usunięty z organizmu w postaci mocznika, a łańcuchy węglowe są wykorzystywane do biosyntezy tłuszczów i węglowodanów.

2. Właściwości aminokwasów- jony obojnacze

Cząsteczka aminokwasu w roztworze wodnym występować może w jednej z trzech postaci:

1 2 3

Przewaga odpowiedniej postaci aminokwasu zależy od pH roztworu.

Wartość pH, przy której cząsteczka aminokwasu występuje głównie jako jon obojnaczy, nazywamy punktem izoelektrycznym (pI). Gdy pH>pI - aminokwas występuje w postaci anionu, gdy pH<pI - aminokwas jest w postaci kationu.

Wzory aminokwasów białkowych

3. Biologicznie ważne peptydy

Aminokwasy tworzą wiele oligopeptydów i polipeptydów odgrywających ważne funkcje w żywych organizmach np.: glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna, tripeptyd H-γ-Glu-Cys-Gly-OH, odgrywa zasadniczą rolę w procesach utleniania i redukcji dzięki obecności grup -SH), angiotensyna II (hormon tkankowy o budowie oktapeptydu H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH, zwęża naczynie krwionośne i jest najsilniejszym czynnikiem podwyższającym ciśnienie krwi, nasila uwalnianie noradrenaliny), bradykinina (hormon tkankowy o budowie nonapeptydu H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH, obniża ciśnienie krwi-zatem działa antagonistycznie do angiotensyny, odpowiedzialna jest również za uczucie bólu, który towarzyszy uszkodzeniu (zranieniu) skóry), oksytocyna (nonapeptyd, hormon tylnego płata przysadki, działa na system mięśni gładkich, zwłaszcza macicy ciężarnej, wywołuje wydzielanie mleka z gruczołów sutkowych w okresie karmienia), wazopresyna (hormon tylnego płata przysadki, nonapeptyd (hormon antydiuretyczny, ADH) zwiększa wchłanianie zwrotne w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobór ADH powoduje moczówkę prostą), gramicydyna S (antybiotyk działający na bakterie Gram-dodatnie, stosowany w leczeniu oparzeń, owrzodzeń, zakażonych ran), substancja P (neurohormon zbudowany z 11 reszt aminokwasowych, bierze udział w przewodzeniu bodźców bólowych), glukagon (hormon zbudowany z 29 reszt aminokwasowych, jest antagonistą insuliny, zwiększa stężenie glukozy we krwi), endorfiny i enkefaliny (grupa oligo- i polipeptydow wyodrębnionych z przysadki mózgowej), insulina (hormon wytwarzany przez komórki β-trzustki, zmniejsza stężenie glukozy we krwi, stosowana w leczeniu cukrzycy) itd.

4. Leki o budowie aminokwasowej

Antybiotyki peptydowe są głównie produktami metabolizmu mikroorganizmów. Często są one odporne na działanie enzymów proteolitycznych, znajdujących się w normalnych komórkach. Przyczyną tego jest nie tylko cykliczna budowa tych antybiotyków, ale także występujące w ich łańcuchach peptydowych, mało spotykane w białkach, elementy strukturalne, takie jak D-aminokwasy, rzadkie aminokwasy i nie peptydowe wiązania między resztami.

Do grupy leków aminokwasowych zaliczyć można penicyliny. Cząsteczka penicyliny jest produktem cyklizacji dwóch aminokwasów: L-cysteiny i D-waliny. Poszczególne penicyliny różnią się od siebie tylko resztą R, którą w przypadku najbardziej znanego antybiotyku z tej grupy jest reszta benzylowa.

penicylina

5. Struktura, podział i właściwości białek

Struktura pierwszorzędowa to kolejność aminokwasów w białkach (polipeptydach) bez uwzględnienia układu przestrzennego. Za utrzymanie tej struktury odpowiedzialne są wiązania peptydowe.

Struktura drugorzędowa - opisuje konformacje łańcuchów (helikalną i pofałdowaną) powstałe w wyniku utworzenia wiązań wodorowych między grupami karbonylowymi i amidowymi głównego łańcucha polipeptydowego oraz mostków disulfidowych.

Struktura trzeciorzędowa określa trójwymiarowe pofałdowanie danego łańcucha polipeptydowego wywołane wewnątrzcząsteczkowym oddziaływaniem łańcuchów bocznych. Strukturę tą stabilizują wiązania wodorowe, mostki disulfidowe i siły van der Waalsa.

Struktura czwartorzędowa - pojęcie to obejmuje występujące w wielu białkach asocjacje monomerów białkowych o oddzielnej strukturze drugo- i trzeciorzędowej w kompleksy oligomeryczne. Asocjacja i agregacja zachodzi w wyniku oddziaływań między polarnymi, zjonizowanymi i niepolarnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów, są to oddziaływania: dyspersyjne, hydrofobowe, jonowe, wodorowe, w kilku wypadkach stabilizacja dzięki mostkom disulfidowym. Przykładami białek o strukturze czwartorzędowej są hemoglobina, wirus mozaiki tytoniowej, dehydrogenaza białczanowa, dehydrogenaza alkoholowa.

Podział białek

Ze względu na różnorodność budowy białek trudno dokonać ścisłej klasyfikacji białek. Najstarszy podział białek oparty został na różnicach w rozpuszczalności białek i kształcie cząsteczek.

Wyróżnia się białka:

1) fibrylarne - o strukturze włóknistej, nierozpuszczalne w wodzie

2) globularne - o strukturze kulistej, rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli

nieorganicznych. Dzieli się je na białka proste (zbudowane tylko

z aminokwasów) i białka złożone (zawierają grupy niebiałkowe jak cukry,

tłuszcze, kwasy nukleinowe, reszty kwasu fosforowego, jony metali).

Właściwości fizyczne białek

1. Mają charakter wielkocząsteczkowy ( białka nie dializują ale ich roztwory wykazują cechy koloidów).

2. Wywierają ciśnienie koloidoosmotyczne.

3. Wędrują w polu elektrycznym (elektroforeza).

4. Ulegają wysalaniu ( (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, NaCl).

5. Skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo.

6. Pochłaniają światło przy 280 nm ( Trp i Tyr ).

7. Wykazują duży współczynnik załamania światła (oznaczanie białka metodą refraktometryczną).

8. Są wrażliwe na podwyższoną temperaturę i inne czynniki denaturujące.

Właściwości chemiczne białek

1. Wykazują kilka klasycznych reakcji, które wykorzystywane są do oznaczeń jakościowych białek (oparte głównie o reakcje aminokwasowe).

2. Ulegają denaturacji (temperatura, mocznik, guanidyny, stężone kwasy, stężone alkohole, jony metali ciężkich, detergenty, garbniki itp.).

3. Ulegają hydrolizie enzymatycznej (pod wpływem: pepsyny, trypsyny, chymotrypsyny), kwaśnej (następuje jednak rozpad tryptofanu, seryny, treoniny), zasadowej (następuje jednak racemizacja, dlatego rzadko stosowana).

4. Wykazują charakter amfolityczny, w zależności od pH środowiska, podobnie jak aminokwasy, mogą występować w trzech formach różniących się ładunkiem i co za tym idzie właściwościami.

kation białkowy białkowy jon obojnaczy anion białkowy

pH<pI pI pH>pI

-nadmiar ładunku - rozpuszczalność i hydratacja -nadmiar ładunku

dodatniego minimalne ujemnego

-wzrost rozpuszczalności - brak wędrówki w polu -wzrost

i hydratacji elektrycznym rozpuszczalności

Punkt izoelektryczny - wartość pH, w której liczba protonów związanych z grupami zasadowymi jest równa liczbie protonów odszczepionych przez grupy kwasowe. Zależy w pewnym stopniu od środowiska (obecności soli).

O całkowitym ładunku białka decydują wszystkie grupy funkcyjne występujące w tym białku, wpływ zaś końcowych grup aminowej i karboksylowej jest minimalny.

6. Biomedyczne znaczenie białek

Ze względu na funkcje biologiczne białka możemy podzielić :

1. Enzymy (dehydrogenazy, kinazy) - regulują szybkość procesów fizjologicznych.

2. Białka zapasowe (ferrytyna, mioglobina).

3. Białka regulatorowe (hormony, białka wiążące się z DNA).

4. Białka strukturalne (kolagen, proteoglikany).

5. Białka ochronne (immunoglobuliny, czynniki krzepnięcia krwi).

6. Białka transportujące (hemoglobina, lipoproteiny osocza).

7. Białka uczestniczące w skurczu (aktyna, miozyna, tubulina).

7. Trawienie i wchłanianie białek

Białka są niezbędne do prawidłowego wzrostu i rozwoju organizmów. Dzienna dawka białek powinna wynosić 0,5 - 0,7 g/kg ciała. W zależności od zapotrzebowania organizmu białka można podzielić na białka pełnowartościowe (zawierające wszystkie aminokwasy egzogenne np.: białka jaja kurzego, mleka, serów, mięsa, fasoli) i niepełnowartościowe (białka pozbawione jednego lub więcej aminokwasów egzogennych np.: białko kukurydzy, żelatyna).

Najlepiej wchłaniają się albuminy, które podobnie jak białka egzogenne są w 80% wchłaniane w dwunastnicy i przednim odcinku jelita czczego. Nie strawione białko dalej dostaje się do jelita grubego gdzie jest rozkładane przez enzymy bakteryjne i wydalane.

U noworodków może wchłaniać się niewielka ilość białek z pokarmu matki- w jelicie cienkim. Ma to duże znaczenie w przyswajaniu globulin mleka matki zawierających przeciwciała, których młody organizm nie umie jeszcze wytwarzać. Zapewnia to odporność bierną noworodków. Wchłanianie to trwa zwykle 36 - 48 h po porodzie, potem zanika.

Trawienie żołądkowe

W żołądku pod wpływem pepsyn białko rozpada się na mniejsze fragmenty oligopeptydowe. Częściowemu rozszczepieniu ulegają prawie wszystkie rodzaje białek pokarmowych z wyjątkiem protamin i keratyny. Sok żołądkowy dzięki dużej zawartości jonów wodorowych powoduje ponadto denaturację, uwodnienie i pęcznienie białek trudno strawnych (kolagen, keratyna, elastyna).

Powstające pod wpływem pepsyn polipeptydy mają masę cząsteczkową od 600 do 3000. Odszczepianie wolnych aminokwasów w żołądku zachodzi zbyt wolno i nie ma większego znaczenia.

Trawienie jelitowe

Mieszanina polipeptydów - produktów trawienia żołądkowego białek przechodzi następnie do jelit, gdzie ulega dalszemu rozkładowi na coraz mniejsze peptydy i aminokwasy. Dzieje się to głównie pod wpływem soku trzustkowego. Przyjmuje się, że końcowym produktem trawienia białek przez proteazy żołądkowe i trzustkowe są krótkie peptydy zwykle 2-6 aminokwasowe. Dalszy ciąg trawienia w świetle jelita stanowi ich hydroliza.

Wchłanianie peptydów

Aminokwasy występujące w treści jelitowej wchłaniają się głównie jako składowe małych peptydów. Wchłanianie aminokwasów jest procesem czynnym zachodzącym przeciw gradientowi chemicznemu. Transport aminokwasów przez śluzówkę jelitową wymaga nakładu energii. Wyróżnia się szereg układów transportujących aminokwasy przez błonę jelitową. Prawidłowo około 10% ilości białka w pokarmach wydalane jest w stolcu. W przypadku zaburzeń trawienia białek odsetek nie wchłoniętego białka wzrasta do 22-85%.

8. Choroby związane z zaburzeniami przemiany aminokwasów

i  białek

Choroby związane z zaburzeniami przemiany aminokwasów

Przyczynami tych chorób są:

• niedobór odpowiednich enzymów

• pierwotne zaburzenia wchłaniania zwrotnego w cewkach nerkowych.

Wspólnym objawem jest obecność aminokwasów w moczu - czyli aminoacyduria. Zaburzenia przemiany aminokwasowej z powodu braku odpowiednich enzymów powodują nagromadzenie się w organizmie toksycznych związków co wtórnie powoduje uszkodzenie tkanek i układów (nerwowego, wydzielniczego).

Jedną z chorób, znaną od 1953 roku jest fenyloketonuria - choroba uwarunkowana genetycznie. Przyczyną jej występowania jest brak lub mała aktywność enzymu-hydroksylazy fenyloalaninowej (enzym ten przekształca fenyloalaninę w tyrozynę). W konsekwencji fenyloalanina przekształca się nie w tyrozynę, a w kwas fenylopirogronowy, którego nadmiar prowadzi do uszkodzenia centralnego układu nerwowego i niedorozwoju u noworodka. Testy przeprowadzane na krwi noworodków dają możliwość wczesnego wykrycia choroby. Leczenie oparte jest o niskofenyloalaninową dietę do szóstego roku życia dziecka, potem CUN staje się odporny na wysokie stężenie fenyloalaniny i może nastąpić powrót do normalnej diety.

Choroby związane z zaburzeniami przemiany białek

Pierwotny niedobór białek ustrojowych występuje od urodzenia i stanowi anomalię dziedziczną, powoduje to zaburzenia gospodarki wodnej ustroju. Ze względu na brak globulin we krwi nie dochodzi do wytwarzania przeciwciał bakteryjnych.

Znacznie ważniejsze zagadnienie stanowią wtórne niedobory białkowe, których przyczynami są:

1. Niedobory spowodowane nadmiernymi stratami białek (przewód pokarmowy, nerki, skóra (oparzenia)).

2. Niedobory spowodowane zwiększonym rozpadem białek.

3. Niedobory powstałe na skutek niedostatecznej podaży w pożywieniu (choroba głodowa).

4. Niedobory spowodowane niedostatecznym lub nieprawidłowym wytwarzaniem białek, co związane jest ze stanami chorobowymi wątroby, trzustki, niedoborem aminokwasów.

Następstwami tych niedoborów są obrzęki, zaburzenia ciśnienia koloidalnego krwi, uszkodzenia naczyń krwionośnych, a w rezultacie upośledzenie czynności wszystkich narządów oraz upośledzenie gojenia się ran.

Nadmiar białek surowiczych jest dość rzadkim zjawiskiem. Wzrost poziomu białek następuje przeważnie wskutek tworzenia się białek szpiczakowych lub innych stanów chorobowych jak np. gościec stawowy, zapalenie płuc.

(Białka szpiczakowe - są to prawidłowe frakcje białkowe występujące w nadmiarze w wyniku zwyrodnienia poszczególnych klonów komórek immunologicznych. Ciekawym zjawiskiem fizyko-chemicznym związanym z nadmiarem białek szpiczakowych jest koagulacja białka Bence-Jonesa w moczu w temperaturze 52-60°C i upłynnienie go pod wpływem dalszego ogrzewania).

9. Chromatografia bibułowa

Chromatografia bibułowa jest odmianą chromatografii podziałowej, w której rolę nośnika odgrywa odpowiednio spreparowana bibuła filtracyjna. Najczęściej używane bibuły pochodzą z firmy Whatmana i w zależności od stosowanej techniki są odpowiednio zróżnicowane (Whatman 1, 2, 3, 3MM).

Chromatografię bibułową można wykonać techniką zstępującą (spływową), wstępującą i krążkową.

W chromatografii zstępującej migracja składników odbywa się z góry w dół, w chromatografii wstępującej wykorzystana jest kapilarna struktura bibuły umożliwiająca migrację solwentu do góry. W chromatografii krążkowej natomiast ruch rozpuszczalnika odbywa się odśrodkowo na krążku bibuły umieszczonym między dwiema płytkami Petriego. Ten sposób rozdziału wymaga niewiele bibuły, pozwala na stosunkowo szybkie uzyskanie rozdziału mieszaniny i umożliwia wywołanie chromatogramu, pociętego na fragmenty, jednocześnie kilkoma próbami identyfikacyjnymi. Ponadto na jednym krążku można wyznaczyć sektory i wykonać jednocześnie rozdziału mieszaniny oraz odpowiednich substancji wzorcowych. Identyfikację poszczególnych składników mieszaniny wykonuje się porównując położenia ich plam i plam odpowiednich substancji wzorcowych oraz obliczając współczynnik R_f

Część praktyczna

1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

2. Wytrącanie, wysalanie białek

3. Identyfikacja dwóch aminokwasów

4. Chromatografia bibułowa aminokwasów

1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

1. Wykrywanie grupy aminowej

Reakcji dezaminacji ulegają wszystkie aminokwasy występujące w strukturze białek zawierające pierwszorzędową grupę aminową -NH₂

Do 2 cm³ wodnego roztworu dowolnego aminokwasu dodać kilka kryształków KNO₂ i parę kropli 5% roztworu kwasu siarkowego. Wydzielają się pęcherzyki azotu.

2. Reakcja z ninhydryną

Aminokwasy zawierające w cząsteczce ugrupowanie -NH₂ tworzą z ninhydryną związek o charakterystycznym niebiesko-fioletowym zabarwieniu. W trakcie tej reakcji aminokwas ulega dekarboksylacji, dezaminacji i utlenieniu. Reakcję tą pozytywnie dają także inne związki zawierające pierwszorzędową grupę aminową czyli np.: aminy, aminocukry, białka, peptydy i amoniak.

Dla proliny i hydroksyproliny reakcja ma nieco inny przebieg. Powstają w jej wyniku: związek o zabarwieniu żółtym dla proliny, różowym dla hydroksyproliny:

Powstające barwne związki są dobrze rozpuszczalne w wodzie, a intensywność zabarwienia jest zależna od stężenia aminokwasu w analizowanym roztworze. Reakcja nadaje się więc do oznaczania ilościowego aminokwasów metodą kolorymetryczną.

Do 1 cm³ roztworu aminokwasu dodać dwie krople 1% roztworu alkoholowego ninhydryny. Po ogrzaniu występuje charakterystyczne zabarwienie: dla większości aminokwasów fioletowo-niebieskie, dla proliny żółte, dla hydroksyproliny różowe.

3. Reakcja z aldehydem mrówkowym

Aminokwasy tworzą z formaldehydem słabą zasadę Schiffa uwalniając jednocześnie proton. Powoduje to zakwaszenie środowiska.

Do probówki dodać 2 cm³ aminokwasu oraz jedną kroplę alkoholowego roztworu fenoloftaleiny. Roztwór zalkalizować 0,1 M NaOH do lekko różowej barwy. Następnie do probówki dodać około 1 cm³ roztworu 3% formaliny zalkalizowanej 1% NaOH wobec fenoloftaleiny do lekko różowej barwy. Po wymieszaniu zawartości probówki różowe zabarwienie roztworu znika.

4. Reakcja ksantoproteinowa

Aminokwasy zawierające w cząsteczce pierścień aromatyczny ulegają reakcji nitrowania stężonym kwasem azotowym tworząc żółte pochodne nitrowe. Tyrozyna ulega tym reakcjom łatwo, tryptofan trudniej. Najtrudniejszy do zaobserwowania jest efekt dodatni tej reakcji dla fenyloalaniny.

Aminokwasy aromatyczne dzięki obecności pierścienia aromatycznego pochłaniają światło o długości 280 nm co jest często wykorzystywane do oznaczeń ilościowych białek metodą kolometryczną.

Do 1 cm³ roztworu aminokwasu aromatycznego dodać 4 krople stężonego HNO₃, a następnie 4 krople stężonego H₂SO₄. Po podgrzaniu występuje żółte zabarwienie pochodnych nitrowych. Roztwór po zalkalizowaniu roztworem 2M NaOH przyjmuje kolor brunatno-pomarańczowy.

5. Wykrywanie tryptofanu

W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami dając barwne produkty kondensacji. Najczęściej używa się aldehydu mrówkowego (reakcja Voisoneta) lub glioksalu (reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa):

Reakcja Voisoneta

Do 1 cm³ roztworu tryptofanu dodać 2-3 krople 3% roztworu aldehydu mrówkowego i 2 cm³ stężonego HCl, wymieszać i pozostawić na około 5 minut. Następnie dodać kilka kryształków suchego NaNO₂ lub KNO₂.

Powstaje brunatne zabarwienie pochodzące od produktu sprzęgania.

6. Odczyn Pauliego na histydynę

Związki imidazolowe, w tym histydyna dają czerwone zabarwienie w reakcji diazowania z kwasem sulfanilowym. Odczynnik Pauliego składa się z trzech roztworów: kwasu sulfanilowego, azotynu sodu oraz węglanu sodowego, które zmieszane tworzą kwas diazobenzenosulfonowy.

W reakcji z tym samym odczynnikiem tyrozyna tworzy żółto-pomarańczowy (herbaciany) produkt reakcji diazowania.

Do 1 cm³ roztworu histydyny dodać kilka kropel świeżo przygotowanego odczynnika Pauliego (1 cm³ roztworu Pauli I, 1cm³ roztworu Pauli II i 2 cm³ roztworu Pauli III).

Dla porównania wykonujemy analogiczną reakcje dla tyrozyny (proporcje jak wyżej).

2. Wytrącanie i wysalanie białek

Większość białek wykazuje istotne różnice w rozpuszczalności w zależności od pH roztworu, mocy jonowej, temperatury. Rozpuszczalność większości białek jest najniższa w okolicach punktu izoelektrycznego. Również dodatek soli obojętnych wykazuje wpływ na rozpuszczalność białek: niskie stężenia soli powodują zwiększenie rozpuszczalności, wysokie stężenia powodują wytrącenie białka w postaci nierozpuszczalnego osadu. Przyczyną tego zjawiska jest dehydratacja cząsteczek białka. Najbardziej efektywnie wysala białka siarczan amonowy, ze względu na bardzo dobrą rozpuszczalność w wodzie, co daje możliwość uzyskania roztworów o wysokiej mocy jonowej. Czynniki zmieniające drugo- i trzeciorzędową strukturę białka takie jak wysoka temperatura, sole metali ciężkich, dodatek mocnych kwasów i zasad, alkoholi czy aldehydów koagulują białka nieodwracalnie - powodują ich denaturację.

1. Do 2 cm³ roztworu kazeiny dodać równą objętość nasyconego roztworu siarczanu amonowego. Wytrąca się osad wysolonego białka. Do probówki dodać następnie 8 cm³ wody i dokładnie wymieszać. Osad wysolonego białka ulega peptyzacji.

2. W trzech probówkach przygotować po 2 cm³ roztworu kazeiny. Do probówek dodawać kroplami i wytrząsać odpowiednio: do pierwszej probówki 5% roztwór soli rtęci, do drugiej probówki 5% roztwór soli ołowiu, do trzeciej 5% roztwór siarczanu miedzi. Zanotować ilość kropel dodanych do momentu wystąpienia zmętnienia i do wypadnięcia obfitego osadu.

3. Identyfikacja dwóch aminokwasów

Ćwiczenie polega na identyfikacji dwóch aminokwasów na podstawie reakcji wymieniowych w poprzednim ćwiczeniu. W każdej z otrzymanych probówek znajduje się roztwór jednego z aminokwasów. Wykonując odpowiednie reakcje należy zidentyfikować otrzymane aminokwasy.

Schemat dołączony na końcu przedstawia tok postępowania przy analizie aminokwasów.

4. Chromatografia bibułowa aminokwasów

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z jedną z podstawowych metod chromatograficznych i jej wykorzystaniem praktycznym przy identyfikacji aminokwasów.

Na krążku bibuły Whatmana nr 1 zaznaczyć lekko ołówkiem środek krążka  i podzielić go promieniście na 5 części, zaznaczyć ołówkiem podział. W odległości ok. 2 cm od zaznaczonego środka narysować okrąg - linię startu. Na linii startu nakropić pasemkami za pomocą kapilary roztwory 4 aminokwasów wzorcowych, a w 5 części analizowaną mieszaninę aminokwasów. W środek krążka włożyć zwinięty rulonik bibuły o długości około 1,5 cm.

Tak przygotowany chromatogram położyć na spodniej części szalki Petriego tak aby zwinięty pasek bibuły zanurzony był w 90% metanolu (układ rozwijający). Spodnią część szalki z położonym chromatogramem należy przykryć górną częścią szalki. Chromatogram po rozwinięciu (kiedy czoło rozpuszczalnika osiągnie wysokość ok. 1 cm od brzegu krążka), wysuszyć na powietrzu, a następnie wywołać 5% etanolowym roztworem ninhydryny, susząc go ponownie w suszarce w temp. około 60 °C. Przez porównanie zabarwienia oraz wartości współczynników R_f otrzymanych pasm aminokwasów badanej mieszaniny ustalić jakie aminokwasy wchodziły w jej skład.

Wykrywanie aminokwasu

A/ reakcja z formaldehydem

B/ reakcja z kwasem azotowym

C/ reakcja ninhydrynowa

kolor różowy-hydroksyprolina kolor niebiesko- fioletowy

kolor żółty - prolina inny aminokwas

Wykrywanie pierścienia aromatycznego

reakcja ksantoproteinowa

bezbarwny lub blado żółty roztwór kolor żółty,

po alkalizacji bezbarwny po alkalizacji pomarańczowy

-aminokwas niearomatyczny - aminokwas aromatyczny

lub histydyna

Wykrywanie tryptofanu

Reakcja Voisoneta

kolor żółty kolor brunatny

tyrozyna lub tryptofan

fenyloalanina

Wykrywanie histydyny i tyrozyny

Reakcja Pauliego

czerwono-wiśniowy kolor pomarańczowy kolor jasno żółty kolor

- histydyna -tyrozyna -inny aminokwas ( np. prolina, alanina)

1

11

1

12

---