Polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych
Polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych lub polimorfizm pojedynczego łańcucha określa się jako konformacyjną różnicę w jednoniciowej sekwencji nukleotydów o identycznej długości która powstała w wyniku różnic w sekwencji pod działaniem specyficznych warunków doświadczenia. Ta właściwość pozwala sekwencjom być rozróżnianym poprzez elektroforezę żelową, która rozdziela fragmenty na podstawie ich konformacji.
Tło fizyczne
Zmiana pojedynczego nukleotydu w konkretnej sekwencji - w dwuniciowej cząsteczce DNA, nie może być uwidoczniona przez elektroforezę, ze względu na to, że fizyczne właściwości tej cząsteczki są niemal identyczne dla obydwu alleli. Po denaturacji, jednoniciowy DNA przechodzi 3-wymiarowe fałdowanie w związku z sekwencją nukleotydową. Różnica w kształcie pomiędzy dwiema jednoniciowymi łańcuchami DNA o różnych sekwencjach powoduje, że przemieszczają się one z różnymi prędkościami w żelu, pomimo że posiadają taką samą ilość nukleotydów - co jest podstawowym zastosowaniem SSCP.
Zastosowanie w biologii molekularnej
SSCP używa się jako metody do wykrywania nowych polimorfizmów DNA nie stosując sekwencjonowania DNA, jednakże obecnie metoda wspomagana jest właśnie przez sekwencjonowanie DNA ze względu na efektywność i skuteczność. Obecnie, SSCP jest najczęściej wykorzystywana jako narzędzie diagnostyczne w biologii molekularnej. Może być używane w genotypowaniu w celu wykrywania osobników homozygotycznych w różnych stanach allelicznych, tak samo jak osobników heterozygotycznych, które mogą reprezentować odrębne wzory na żelu podczas elektroforezy.
SSCP jest także szeroko używana w wirusologii w celu wykrywania zmienności w różnych typach wirusów. Istnieje pogląd, że dana cząstka wirusa obecna w obu szczepach poddawana zmianom w wyniku mutacji i że zmiany te skutkują powstaniem dwóch cząsteczek o różnych kształtach, co może być uwidocznione na żelu SSCP.
PCR-SSCP (single strand conformation polimorphism - polimorfizm konformacji pojedynczych nici DNA)
Technika jest prostym i skutecznym sposobem wykrycia zmian w sekwencji nukleotydów produktów reakcji PCR. Pozwala między innymi na uwidocznienie różnych alleli danego genu. Metoda opiera się na założeniu, że niewielkie zmiany w sekwencji nukleotydów mają wpływ na zmianę struktury przestrzennej pojedynczej cząsteczki DNA co wpływa na różnicę w migracji DNA w żelu. Produkty reakcji PCR po denaturacji układają się we właściwe dla swojej sekwencji struktury przestrzenne. DNA różniące się sekwencją nukleotydową różni się również strukturą przestrzenną przez co wykazuje inną ruchliwość na żelu, widoczną jako różnica w odległości prążków.
Pierwszym etapem SSCP jest amplifikacja DNA klasyczną metodą PCR. Produkty PCR są następnie denaturowane i rozdzielane na żelach poliakrylamidowych w warunkach nieredukujących. Końcowym etapem jest wizualizacja produktów w żelu z użyciem np. bromku etydyny.
Procentowość żelu do elektroforezy waha się w granicach od 8-20% ale większość produktów PCR jest rozdzielana z dobrymi wynikami w 12% żelu. Stosunek bis-akrylamidu do akrylamidu: 1:49. Żel przygotowuje się z 10% glicerolem.
Metoda SSCP-PCR przepis:
Amplfikacja DNA metodą PCR z użyciem specyficznych primerów.
Denaturacja produktów PCR: ok. 4 μl produktów PCR i 12 μl formamidu zmieszać w ependorfie denaturację prowadzić w temperaturze 95°C przez 10 minut Następnie próby schłodzić na lodzie.
Elektroforeza: nanieś próbki na żel. Elektroforezę prowadzi się w 0,5 x buforze TBE przy natężeniu prądu od 10-12.5 voltów/cm żelu przez 2-24 godzin w temperaturze pokojowej.
Wizualizacja: wybawienie żelu w bromku etydyny i analiza produktów w UV.
Odczynniki:
10 x stężony bufor TBE o pH= 8,3:
0,890 mM Tris
0,890 mM kwas borowy
0,220 mM EDTA
12% żel poliakrylamidowy: 50ml:
12ml 50% akrylamid-bisakrylamid (49:1)
2,5ml 10% buforu TBE
5ml glicerolu
30,5ml wody bidestylowanej