Oznaczanie obecności pałeczek Salmonella spp. w żywności
Enterobacteriaceae (enterobakterie-pałeczki jelitowe)
Rząd: Enterobacteriales,
Rodzina: Enterobacteriaceae
To gram-ujemne bakterie jelitowe o kształcie pałeczek, niesporulujące, fermentujące glukozę i tworzące kwas
Komórki bakteryjne są dość duże, urzęsione (nieliczne wyjątki). Niektóre szczepy są otoczkowe.To względne beztlenowce. Hoduje się je na prostych podłożach, w warunkach normalnej atmosfery
Rodzina Enterobacteriaceae- kilkadziesiąt rodzajów bakterii!
Salmonella
Proteus
Escherichia
Hafnia
Enterobacter
Edwardsiella
Erwinia
Citrobacter
Yersinia
Aquamonas
Klebsiella
Rodzina Enterobacteriaceae
Plesiomonas
Providencia
Leclercia
Morganella
Shigella
Serratia
Cronobacter
Enterobacter (Cronobacter) sakazakii
PIF
Charakterystyka pałeczek z rodzaju Salmonella
Są to ruchliwe, gram-ujemne pałeczki o wymiarach ok. 0,6-3μm, należące do rodziny Enterobacteriaceae. Dobrze rosną w warunkach tlenowych i beztlenowych. Nie tworzą przetrwalników. Ich temperatury rozwojowe mieszczą się w granicach 5- 45°C. Są wrażliwe na wysoką temperaturę, ale wykazują dużą wytrzymałość na wysuszanie. Wykazują wrażliwość na wysokie stężenia NaCl (tolerancja do 9%) oraz niskie pH.
Charakterystyka pałeczek z rodzaju Salmonella
Fermentują glukozę, natomiast nie fermentują laktozy i sacharozy, co jest ważną cecha podczas ich identyfikacji. Są zdolne do dekarboksylacji lizyny, ornityny i argininy. Redukują azotany, wytwarzają siarkowodór. Nie upłynniają żelatyny i nie rozkładają mocznika (cecha różnicująca z Proteus spp.- test na wytwarzanie ureazy).
Systematyka pałeczek Salmonella spp.
Rodzaj Salmonella obejmuje dwa gatunki: S. enterica i S. bongori. Gat.Salmonella enterica podzielony został na 6 podgatunków, a każdy z nich, ze względu na różnice w budowie antygenów, na typy serologiczne- tzw. serowary
Systematyka pałeczek Salmonella spp.
S. bongori (20 serowarów)
Zaliczamy tu niezwykle rzadko występujące serowary, o znikomej lub niezbadanej patogenności dla człowieka. Serowary te izolowane są najczęściej od zwierząt zmiennocieplnych, takich jak węże czy niektóre gatunki żółwi i jaszczurek.
Systematyka pałeczek Salmonella spp.
S. enterica- w obrębie gatunku wyróżniamy 6 podgatunków (subspecies) :
enterica (ponad 2500 serowarów)
salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
Salmonella enterica spp. enterica:
Do głównych serowarów należą:
S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Virchow, S. Hadar – odpowiedzialne za zapalenie jelita cienkiego i grubego
S. Typhi - wywołujący dur brzuszny
S. Paratyphi – wywołujący dury rzekome
Istnieją także gatunkowo specyficzne serowary Salmonella spp.
S. Dublin- cielęta
S. Gallinarum, S. Pullorum- drób
S. Typhi- człowiek
Występowanie
Pałeczki Salmonella spp. najczęściej zasiedlają przewód pokarmowy zwierząt domowych oraz dzikich, drobiu hodowlanego, ptaków, owadów, a także gryzoni. Dużą rolę w przenoszeniu pałeczek Salmonella spp. odgrywają produkty roślinne, szczególnie z terenów nawożonych fekaliami (krążenie pałeczek jelitowych w przyrodzie).
Występowanie
Źródłem zanieczyszczenia żywności mogą być także ludzie chorzy i nosiciele tych bakterii. Z racji dużej oporności na wysuszanie, pałeczki te mogą przeżywać przez długi czas w kurzu, paszach, suszonej żywności.
Występowanie
Zarazki te bardzo dobrze radzą sobie także w produktach płynnych i mrożonych, w których przeżywają przez długi czas w stanie anabiozy. Najczęściej izolowane są z jaj oraz produktów je zawierających (lody, ciastka, kremy, czekolada).
Raport EFSA 2012
99.020 przypadków salmonellozy u ludzi w 2010r w UE (raport EFSA 2012)
Najwięcej przypadków odnotowano w Niemczech, Wlk. Brytanii, Polsce i Czechach
Dominujące serowary : S.Enteridtidis (45%) i S. Typhimurium (22.4%)
Bakteryjne Zatrucia pokarmowe w Polsce od 1 stycznia do15 grudnia 2012 r.
oraz w porównywalnym okresie 2011 r.
Zakład Epidemiologii NIZP-PZH http://www.pzh.gov.pl
2012 2011
Salmonelloza 8,295 8,627
E.coli biegunkotwórcza 513 622
Kampylobakterioza 403 339
Yersinioza 189 233
Gronkowce 147 280
Salmonella in food
(najwyższy indeks niezgodności)
mielone mięso drobiowe i wyroby z niego pochodzące przeznaczone do spożycia po obróbce termicznej
mięso mielone i wyroby mięsne przeznaczone do spożycia na surowo
owoce morza
surówki warzywne i sałatki owocowe (RTE food)
produkty jajeczne
wyroby mięsne i drobiowe przeznaczone do spożycia
po obróbce termicznej
produkty mleczne ( z mleka niepasteryzowanego lub
poddanego łagodnej obróbce termicznej)
Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa
Do uruchomienia całej kaskady procesu chorobotwórczego niezbędna jest inwazja drobnoustroju. Substancje o charakterze toksyn, wyzwalające objawy chorobowe, wydzielane są dopiero w organizmie gospodarza, a nie w żywności, jak w przypadku gronkowcowych zatruć pokarmowych.
Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa
Czynnikami wirulencji zarazka są:
organella i struktury komórkowe o właściwościach adhezyn i białek inwazyjnych (np. OMP), umożliwiające mu bezpośredni kontakt z komórkami makroorganizmu (adherencję) lub wnikanie do ich wnętrza.
Substancje o charakterze toksyn wyzwalające objawy chorobowe.
Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa
Do substancji o charakterze toksyn zaliczamy:
LPS ściany komórkowej (charakter endotoksyny, działanie pyrogenne)
Ciepłooporne i ciepłowrażliwe enterotoksyny identyczne z enterotoksynami ST i LT E.coli, wpływające na zmianę aktywności sekrecyjnej i enterosorpcyjnej nabłonka jelitowego
Cytotoksyny wywołujące nasilone zmiany zapalne i destrukcję komórek nabłonka jelitowego np. Shiga T
Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa
Dwie podstawowe formy kliniczne salmonellozy:
zatrucie pokarmowe- gastroenteritis; jest to postać lokalna choroby
gorączki durowe, przebiegające pod postacią infekcji uogólnionych
Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa
Dawka infekcyjna dla człowieka to ok. 105 kom/g zanieczyszczonej żywności. Dla osób starszych i niemowląt już 102 kom/g (100 komórek/1 gram) może się okazać wystarczające do wywołania choroby.
Po przedostaniu się do przewodu pokarmowego pałeczki Salmonella spp. zdolne są do namnażania w jelicie cienkim, kolonizacji i przenikania w głąb ściany jelita. Po uwolnieniu endotoksyn zawartych w komórkach widoczne są objawy salmonellozy: gorączka, bóle brzucha, biegunka, wymioty. Objawy widoczne są po 12-48h od wprowadzenia zarazka do organizmu.
Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa
Krótko po wystąpieniu objawów zarazki pojawiają się w kale, natomiast bardzo rzadko dochodzi do ich wysiewu do krwi.
Najczęściej do uogólnienia procesu chorobowego dochodzi w przypadku zakażeń S. Choleraesuis, wtedy następuje gwałtowna zwyżka temperatury (nawet do 40 st. C), a zarazki można wyodrębnić w posiewach z krwi.
Z krwiobiegiem Salmonella przenoszona jest do różnych narządów, np. płuc, stawów, serca, powodując lokalne zapalenia (pneumonia, osteomielitis, endocarditis, meningitis)
W przypadku implantacji w pęcherzyku żółciowym, rekonwalescent staje się długotrwałym nosicielem i siewcą zarazka.
Dur brzuszny
typhus abdominalis
PN-EN ISO 6579: 2003
PN-EN ISO 6579: 2003/ A1 2007
Mikrobiologia żywności i pasz
Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp.
Etapy identyfikacji pałeczek Salmonella sp.
Oznaczanie obecności pałeczek Salmonella sp. w próbkach żywności obejmuje kilka etapów:
I. Przednamnażanie na wodzie peptonowej
II. Namnażanie selektywne na pożywce półpłynnej
III. Różnicowanie na podłożach agarowych
IV. Identyfikacja w oparciu o testy biochemiczne i serologiczne
Schemat postępowania
Badana próbka
Zbuforowana woda peptonowa
37 ºC / 18h
Zmodyfikowana pożywka półpłynna Rappaport-Vassiliadis
41.5 ºC / 24h
Agar selektywny
XLD + BGA lub pożywka bizmutawo-siarczynowa
37 ºC / 24h
Badania potwierdzające
Salmonella sp. - stosowane podłoża
Zbuforowana woda peptonowa - pożywka stosowana w celu nieselektywnego namnażania pałeczek Salmonella sp., sprzyja regeneracji komórek uszkodzonych podczas procesów technologicznych.
Zmodyfikowana pożywka półpłynna Rappaport-Vassiliadis (MSRV) – silnie selektywna, zawiera w swoim składzie zieleń malachitową i chlorek sodu, które hamują wzrost mikroflory towarzyszącej.
Pożywka XLD – zawiera laktozę, L-lizynę, ksylozę, dezoksycholan sodu. Typowe kolonie Salmonella sp. są lekko przezroczyste z czerwonym brzegiem i czarnym centrum.
Pożywka BGA - z zielenią brylantową, czerwienią fenolową, laktozą, sacharozą. Typowe kolonie Salmonella sp. są koloru podłoża (różowe) i otoczone jasno-czerwoną strefą.
Salmonella- wzrost na pożywce XLD
Na pożywce XLD typowe kolonie Salmonella mają czarne środki i są otoczone lekko przezroczystą strefą koloru jasnoczerwonego; wokół kolonii zwłaszcza przy gęstym wzroście Salmonella widoczna jest strefa różowoczerwona, różnej szerokości.
Salmonella- wzrost na pożywce XLD
Czarne zabarwienie centralnej części kolonii wynika ze zdolności do produkcji siarkowodoru (H2S)
Barwa różowa pożywki wokół kolonii dowodzi zdolności dekarboksylacji lizyny obecnej w pożywce XLD
Salmonella - XLD
Salmonella- podłoże XLD
Szczepy Salmonella nie wytwarzające siarkowodoru np. (S.Paratyphi A) rosną na pożywce XLD w postaci różowych kolonii z ciemniejszymi, różowymi środkami
Salmonella - XLD
Escherichia coli - XLD
Salmonella- wzrost na podłożu BGA
Charakterystyczne kolonie są koloru podłoża (różowe) i otoczone jasno-czerwoną strefą.
Ponieważ bakterie z rodzaju Salmonella nie fermentują laktozy (poza nielicznymi szczepami) ani sacharozy, dochodzi do alkalizacji podłoża i różowego wybarwienia pożywki.
Salmonella - BGA
Salmonella na BGA Agar.
Escherichia coli on BGA Agar. E. coli rozkłada laktozę zawartą w pożywce. Dochodzi do zakwaszenia podłoża i zmiany barwy pożywki na cytrynowo- żółtą.
Właściwości biochemiczne –
podłoże TSI (Kliglera)
- Triple Sugar Iron agar
Agar trójcukrowy (glukoza, laktoza, sacharoza)TSI
- podłoże ma postać słupka i półskosu,
- posiewy wykonuje się w dwojaki sposób: na powierzchni skosu i wgłębnie.
- dokonujemy obserwacji fermentacji glukozy (barwa słupka), laktozy (barwa skosu), wytwarzania gazu (pęcherzyki gazu, porozrywany agar) oraz wytwarzanie H2S (barwa czarna).
Reakcje zachodzące w podłożu TSI
→ Salmonella ← → E. coli ←
Podłoże TSI (Kliglera)- Triple Sugar Iron agar
Podłoże SS Salmonella- Shigella
Zawiera laktozę, cytrynian sodu, cytrynian żelazowy, oraz czerwień obojętną i zieleń brylantową
To podłoże wybiórcze stosowane do izolacji pałeczek Salmonella i Shigella
Zahamowany jest wzrost flory G+
oraz częściowo E. coli
Podłoże SS Salmonella- Shigella
Drobnoustroje laktozododatnie (E. coli) rosną w postaci czerwonych kolonii lub bezbarwnych, z czerwonymi środkami
Salmonella i Shigella tworzą kolonie bezbarwne, przejrzyste, a szczepy wytwarzające siarkowodór tworzą kolonie z czarnymi środkami
Proteus wzrost obfity, w formie gładkiej, tworzy kolonie duże, płaskie koloru żółtego. Szczepy wytwarzające siarkowodór tworzą również kolonie z czarnym środkiem.
Pozostałe próby biochemiczne:
Wytwarzanie ureazy na pożywce Christensena
Dekarboksylacja lizyny
Wykrywanie ß-galaktozydazy
Reakcja Vogues-Proskauera (VP)
Wytwarzanie indolu na pożywce z tryptofanem
Badanie serologiczne kolonii podejrzanych o przynależność do Salmonella spp.
Podstawą klasyfikacji pałeczek Salmonella są różnice we właściwościach antygenowych.
Metoda badania: aglutynacja szkiełkowa
Określamy obecność antygenów somatycznych (O), rzęskowych (H) oraz otoczkowych (Vi)
Badanie serologiczne- c.d.
Wykluczamy szczepy zdolne do autoaglutynacji (roztarcie niewielkiej ilości hodowli z agaru odżywczego z kroplą soli fizjologicznej).
Czas oczekiwania 30-60s., obserwacja szkiełka na czarnym tle, lupa powiększająca
Badanie serologiczne- c.d.
Pierw badanie na obecność antygenu rzęskowego (H)
Następnie ocena reakcji z surowicami anty-O. Używamy kolejno surowicy poli- i monowalentnej. W przypadku badania żywności nie używamy surowicy grupowo specyficznej anty-OA ( S.Typhi, S. Paratyphi- serowary te nie są specyficzne dla żywności)
Badanie serologiczne- c.d.
Korzystamy z surowic anty- OD, OB, OC i OE (bo niemal 100% szczepów izolowanych z żywności należy do tych serogrup)
Wykrywanie obecności antygenów otoczkowych Vi
Potwierdzenie ostateczne
Szczepy, określone jako Salmonella lub podejrzane o przynależność do rodzaju Salmonella, w razie niejasności, należy przesłać do ośrodka referencyjnego dla tego drobnoustroju, w celu wykonania ostatecznego typowania.
Do przesłanego drobnoustroju należy dołączyć wszelkie informacje na jego temat.
Dziękuję za uwagę