Grupa pt 12:15 dr inż. Dominika Bystranowska

Magdalena Ciesielska 193237

Paulina Plesner 193333

Joanna Ratajczyk 191837

Enzymologia – laboratorium

Ćwiczenie 1

„Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka przez reakcję

z barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G-250”

1. Cel ćwiczenia:

Oznaczenie stężenia białka immunoglobuliny G metodą Bradford w buforze standardowym oraz w obecności NaCl.

1. Przebieg ćwiczenia:

1. Przygotowanie standardu immunoglobuliny G:

a) Pobrano 0,5 ml standardu do probówki i dodano do niego 2 ml buforu standardowego.

b) Zmierzono ekstynkcję otrzymanego roztworu przy 280 nm.

c) Na podstawie pomiaru ekstynkcji i odpowiedniego współczynnika ekstynkcji (dla immunoglobuliny A₂₈₀^0,1%=1,5) wyliczono rzeczywiste stężenie standardu.

d) Przygotowano serię rozcieńczeń standardu (dopełnioną buforem standardowym), w taki sposób, że otrzymano kolejno 0 μg, 1 μg, 2 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 40 μg białka w 100 μl buforu standardowego.

Tabela 1

Przygotowanie standardu immunoglobuliny G
Nr próbki
1
2
3
4
5
6
7

2. Przygotowanie białka immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu:

a) Do czterech probówek dodano kolejno po 10 μl, 20 μl, 40 μl, 60 μl roztworu immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu.

b) Dopełniono buforem do 100 μl.

Tabela 2

Immunoglobulina G o nieznanym stężeniu
Nr próbki
1
2
3
4

3. Przygotowanie białka immunoglobuliny G o znanym stężeniu w obecności NaCl:

a) Do czterech probówek dodano kolejno po 41 μl białka (10 μg)

b) Do probówek z białkiem dodano następnie: 0 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl NaCl

c) Probówki uzupełniono do 100 μl buforem standardowym.

Tabela 3

Stężenie białka w obecności NaCl
Nr próbki
1
2
3
4

1. Wyniki i obliczenia:

Obliczenia:

1. Obliczenie rzeczywistego stężenia standardu:

Gdzie:

ε – współczynnik ekstynkcji

l – długość drogi w warstwie optycznej roztworu

A – absorbancja

C – stężenie badanej substancji

Do pomiaru użyto roztwór rozcieńczony 5-krotnie.

Rzeczywiste stężenie standardu: 0,477

1. Obliczenie objętości standardu i buforu potrzebnych do przygotowania rozcieńczeń:

standard:

bufor:

100-2=98 []

1. Obliczenie masy rzeczywistej:

2. Wykres krzywej standardowej:

3. Oznaczanie masy i stężenia białek na podstawie równania krzywej standardowej:

Tabela 4

Białko	Nr próbki	A595	A465	A595/A465	mx [µg]	Vx [µl]	Cx [µg/µl]	Cxśr [µg/µl]
Immunoglobulina G o nieznanym stężeniu	1	0,542	0,980	0,553	1,122	10	0,112	0,092
	2	0,605	0,902	0,671	2,325	20	0,116
	3	0,629	0,936	0,672	2,335	40	0,058
	4	0,789	0,855	0,923	4,894	60	0,082

1. Oznaczenie stężenia odczynnika NaCl:

Tabela 5

Białko	Nr próbki	A595	A465	A595/A465	Vodcz [µl]	Codcz [µg/µl]	mx [µg]	Vx [µl]	Cx [µg/µl]
Immunoglobulina G w obecności NaCl	1	0,611	0,944	0,647	0	0	2,081	20	0,104
	2	0,580	0,952	0,609	10	17,50	1,693	20	0,085
	3	0,552	0,954	0,579	20	35,10	1,387	20	0,069
	4	0,538	0,959	0,561	50	87,75	1,204	20	0,060

1. Wnioski:

• Cel ćwiczenia został zrealizowany. Udało się oznaczyć stężenie białka immunoglobuliny G (C=0,92 µg/µl) metodą Bradford. Wykorzystana metoda jest czuła, prosta, szybka oraz niewrażliwa na obecność zanieczyszczeń. W powyższej metodzie stosuje się barwnik Coomassi Bright Blue G-250, który posiada dwa maksima absorbcji 465nm oraz 595nm w kompleksie z białkiem. Na podstawie wyników pomiaru absorbancji można zauważyć wzrost ekstynkcji przy długości fali 595nm odpowiadający coraz większej liczbie białek tworzących kompleks z barwnikiem. Natomiast przy długości fali 465nm absorbancja maleje na skutek zmniejszania się ilości wolnego barwnika CBB G-250 (w wyniku tworzenia się kompleksu barwnik-białko).

• Wynik pomiaru ekstynkcji próbki numer 3 w tabeli 4 wskazuje na niedokładności podczas pipetowania. Przez co stężenie białka jest zaniżone w stosunku do pozostałych pomiarów.

• Wraz ze wzrostem siły jonowej związanej z dodawaniem coraz to większej objętości NaCl, większa liczba białek ulega wytrąceniu, przez co mniej białek ulega kompleksowaniu z barwnikiem Comassie Bright Blue G-250. Jest to związane ze zmniejszaniem stężenia białka na skutek wysalania.

LITERATURA:

[1] Jakób M. Kolorymetryczne oznaczenie stężenia białka przez reakcję z barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G-250 Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z enzymologii

[2] Streyer L., BergJ. , Tymoczko J. „Biochemia”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009, str.68