Enzymologia

Wykład 1

4.10.2010

Enzymologia – nauka zajmująca się badaniem struktury i możliwości stosowania białek katalitycznych – enzymów.

Zakres klasycznych zagadnień, które obejmuje enzymologia:

• Wyodrębnianie enzymów z materiału biologicznego i ich oczyszczanie do stanu homogennego.

• Badanie składu chemicznego i struktury molekularnej enzymów.

• Wyjaśnianie katalitycznego mechanizmu działania enzymów i ustalanie reakcji miedzy struktura a katalityczna funkcją.

• Badania kinetycznych i termodynamicznych właściwości enzymów.

• Badanie biosyntezy enzymów i mechanizmów jej regulacji.

• Ustalanie lokalizacji enzymów w komórce, a w przypadku enzymów pozakomórkowych badanie mechanizmów ich sekrecji

• Ewolucja enzymów: katalizowanie się funkcji enzymów w procesie ewolucji, określanie stopnie homologii enzymów, ewolucyjne rodziny enzymów.

Nowe tendencje w enzymologii:

• Poszukiwanie nowych aktywnych enzymów, zwłaszcza u organizmów z ekstremalnych biotopów.

• Ulepszanie natywnych enzymów, ukierunkowana ewolucja enzymów In vitro.

99% enzymów to enzymy mikrobiologiczne pochodzące od drobnoustrojów, stąd większa pula genów powinna być niedostępna dla biotechnologii - stąd nowe metody w enzymologii.

Ulepszanie enzymów

Metoda dająca szybkie efekty to ukierunkowana ewolucja enzymów In vitro. Cięcie genów i łączenie ich przypadkowo oraz metoda amplifikacji – powielania DNA wyjściowego; polimerazy wprowadzają błędy co uniemożliwia utworzenie różnych wariantów genów, a w konsekwencji większe prawdopodobieństwo uzyskania wariantu o lepszej cesze. Szybka selekcja klonów – technika wysokoprzepustowego screeningu.

Inny grupy biokatalizatorów:

• Rybozomy (RNA),

• Enzymy (białka katalityczne)

• DNA-zymy - Fragmenty cząsteczki DNA (metabolizm kwasów) (In vitro) - katalizują reakcje związane z syntezą kwasów nukleinowych.

• Mikrozymy - Białka enzymatyczne mają masy cząsteczkowe od 10 do kilku milionów Daltonów, w ostatnim przypadku chodzi o enzymy oligomeryczne. W mikroorganizmach występują mikrozymy w zasadzie peptydy katalityczne. Ich badanie nie jest łatwe, ponieważ trudno jest je wyizolować z materiału genetycznego. Najmniejszym opisanym mikrozymem jest lipaza zbudowana z 17 aminokwasów. Hydrolizuje triacyloglicerole.

• Katalityczne przeciwciała – białka o specyficznej strukturze charakterystycznej dla przeciwciał. Niektóre z nich wykazują aktywność. Niektóre przeciw In vitro katalizują reakcje ale i w warunkach In vivo. Przykładem przeciwciała o właściwości allilolitycznej są przeciwciała w mleku matki.

W biotechnologiach: przemysłowej (biała), medycznej (czerwona), agrotechnologii (zielona), ochronie środowiska (fioletowa), enzymy są podstawą. Wykorzystuje się w biotechnologii całe komórki, mieszaniny enzymów lub ich części.

Obniżanie kosztów uzyskuje się przez:

• Stosowanie enzymów niehomogenicznych,

• Stosowanie mas biotechnologicznych,

• Stosowanie enzymów im mobilizowanych – enzym można wykorzystać wielokrotnie.

Wykład 2

11.10.2010

Enzym – chiralny „rozpuszczalnik” określonego substratu (ów), zapewniający środowisko reakcji odpowiednie dla optymalnego efektu katalitycznego. Efekt ten wynika z chiralności wszystkich enzymów.

1. Są to białka o masie z zakresu 9-155 kDa, jeśli są zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego i do 6x 10⁶ Da w przypadku enzymów oligomerycznych. Enzym monomeryczny nie musi składać się z jednego łańcucha polipeptydowego. Ale też są i takie enzymy monomeryczne które składają się z większej ilości łańcuchów (np. chymotrypsyna 3 łańcuchy), połączonych mostkami disiarczkowymi.

2. Charakteryzują się strukturalną czułością , specyficznością, tj. decydują o kierunku przemiany substratu (-ów) o określonej strukturze. Ich specyficzność jest wyższa niż innych katalizatorów. Mają zdolność rozpoznawania substratów i wiązania tylko tych, które są strukturalnie dopasowane do centrum aktywnego danego enzymu. Działają specyficznie: nadają kierunek reakcji np. czy będzie utlenianie, jest to specyficzność kierunkowa, oraz decydują jaki substrat oraz substraty ulęgną reakcji. Jest to specyficzność substratowa.

3. Przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji o co najmniej 10⁶ raza, dzięki znacznemu obniżeniu swobodnej energii aktywacji. Jest to efektem zmiany molekularnego mechanizmu reakcji niekatalizowanej (spontanicznej). Reakcje niekatalizowane przez enzymy charakteryzują się o wiele wyższa bariera energetyczna niż reakcji katalizowane przez enzymy. Enzymy nie zmieniają stałej wartości szybkości reakcji, przyśpieszają osiągniecie stanu równowagi.

Przykłady:

2H₂O₂2H₂O + O₂

Stała katalityczna (liczba obrotów enzymu) – Liczba cząsteczek substratu przemieniona w ciągu jednej sekundy przez jedna cząsteczkę enzymu.
Np. katalaza – 1 cząsteczka enzymu przekształca 10 milionów cząsteczek nadtlenku wodoru w ciągu jednej sekundy.

Dlaczego enzymy działają specyficznie?

• Cechą, która najbardziej odróżnia enzymy od innych katalizatorów jest ich zdolność takiego wiązania substratów, aby ich atomy były maksymalnie zbliżone do siebie, a także maksymalnie zbliżone do odpowiednich katalitycznych reszt aminokwasów centrum aktywnego. Odległości między atomami w takim układzie wynoszą tyle co długość wiązania kowalencyjnego, co skutkuje zwiększeniem reaktywności substratu po połączeniu z enzymem.

• Ważna jest odpowiednia budowa CA, które jest przystosowane do określonego substratu, tak aby odpowiednie atomy substratu i katalityczne reszty aminokwasów enzymu były zbliżone. Substrat jest unieruchomiony w połączeniu z enzymem, co ogranicza jego ruchy rotacyjne.

W procesie katalizy enzymatycznej decydujące znaczenie mają:

1. Odpowiedni układ grup chemicznych łańcuchów bocznych aminokwasów, zdolny do zdeformowania i polaryzacji wiązań cząsteczki substratu, tak, aby uczynić ją bardziej reaktywną.

2. Odpowiednia budowa centrum wiążącego, które unieruchamia cząsteczkę substratu w położeniu odpowiadającym ułożeniu grup reaktywnych w centrum aktywnym enzymu.

E + SESEPE + P

1. Etap fizyczny to związanie cząsteczki substratu w CA, jest wynikiem zderzenia cząsteczki enzymu z cząsteczką substratu. Nie wszystkie zderzenia są skuteczne (efektywne) ze względu na energię kinetyczną substratu i enzymu, a także In vivo w tym środowisku w komórce znajduje się wiele rozmaitych związków które mogą się z enzymem zderzać.

Etap ten jest charakteryzowany przez stałą Michaelissa, a jej odwrotność to powinowactwo enzymu do substratu czyli wiązalność danego substratu przez enzym.

Dopiero wówczas kiedy w centrum aktywnym ulokuje się i zwiąże się substrat specyficzny względem danego enzymu, może nastąpić etap chemiczny.

1. Etap chemiczny jest poprzedzony zmianami konformacyjnymi enzymu zachodzącymi w trakcie wiązania substratu. Jest to układ dynamiczny. Jeżeli do Centrum Aktywnego dostanie się substrat specyficzny dla danego enzymu wówczas zmienia się usytuowanie pewnych grup funkcyjnych cząsteczki enzymu, zmienia się konformacja enzymu na bardziej ścisłą. Centrum Aktywne jest zlokalizowane w kieszeni katalitycznej we wgłębieniu białka globularnego jakim jest enzym. Etap wiąże się z konformacyjnym stresem co przejawia się uporządkowaniem układu, czyli gwałtownym spadkiem entropii układu, dzięki czemu może nastąpić przekształceniu cząsteczki substratu w produkt. Skutkuje to osiągnięciem stanu przejścia (tranzycji) i w tym stanie następuje przekształcenie substratu w produkt reakcji. Reakcja w tym stanie przebiega spontanicznie, szybko.

2. Ostatnim etapem jest oddzielenie cząsteczki enzymu z kompleksu enzym-produkt, a enzym wraca do konformacyjnego stanu sprzed reakcji.

Całość reakcji jest charakteryzowana przez iloczyn odwrotności stałej Michaellisa i stałej katalitycznej i jest to stała wydajności katalitycznej, często określana jako stała specyficzności reakcji danego enzymu.

$$K_{\text{ef}f} = \frac{k_{\text{kat}}}{K_{m}}\ \left\lbrack \frac{1}{s} \bullet \frac{\text{dm}^{3}}{\text{mol}} \right\rbrack$$

Dla enzymów które są dobrze zoptymalizowane jeśli chodzi o ich strukturę ta stałą efektywności jest rzędu 10^15-17 Uważa się takie enzymy za prawie idealne do katalizowanie danej reakcji.

Centrum Aktywne:

Zbudowane jest z Obszaru wiążącego i obszaru katalitycznego. Są one oddzielone od siebie. Substrat wiązany jest wiązaniami elektrostatycznymi lub kowalencyjnymi w Centrum aktywnym. Drugim obszarem jest obszar katalityczny. W tych dwóch obszarach można wyróżnić dwa rodzaje aminokwasów: kontaktowe (znajdują się najbliżej, w odległości równej długości wiązania kowalencyjnego od atomów substratu, odpowiadają za specyficzność działania. Poza obszarem również są aminokwasy stabilizujące. Wymiana tych aminokwasów wpływa na działanie enzymów. Aminokwasy pomocnicze, nie wiadomo jaką funkcje spełniają w katalizie. Jeżeli się otrzyma muteinę (zmutowane białka), wymiana aminokwasów pomocniczych skutkuje obniżenie aktywności enzymu.

Przykłady aminokwasów katalitycznych.

Aminokwas	Reaktywna grupa	Ładunek w pH 7	Funkcja
ASP	-COO^-	-1	Wiązanie ketonów, transformacje Protnów
GLU	j.w	j.w.	j.w.
HIS	Imidazol	Ok. 0	Przeniesienie protonów
CYS	-CH2SH	Ok. 0	Kowalencyjne wiązanie grup acylowych
TYR	Fenolowa	0	Wiązanie wodoru z ligandem
LYS	-NH3^+	+1	Wiązanie anionów, przenoszenie protonów
ARG	Guidynowa	j.w.	Wiązanie anionów
SER	-CH2OH	0	Kowalencyjne wiązanie grup acylowych

Koncepcje:

Koncepcja Fischera „klucz-zamek”

Enzym w kompleksie z substratem nie zmienia swojej konformacji – teoria nieprawidłowa. Koncepcja o trójpunktowym łączeniu cząsteczek substratu i enzymu – nie zakład zmian konformacyjnych. Koncepcja o wzbudzonym dopasowaniu (koncepcja Koschlanda)– koncepcja prawdziwa; zakłada, że łączenie substratu z enzymem skutkuje znacznymi zmianami konformacyjnymi – przejście do konformacji bardziej skompaktowanej (ścisłej).

Hierarchiczne poziomy strukturalnego uporządkowania cząsteczki Białka globularnego:

1. Struktura I-rzędowa: sekwencja aminokwasów = sekwencja wiązań peptydowych, niektórzy za strukturę I-rzędowa uznają opis wszystkich wiązań kowalencyjnych, łącznie z disulfidowymi.

1. Struktura II-rzędowa – konformacja krótkich fragmentów łańcucha polipeptydowego, konformacja głównego łańcucha (bez reszt bocznych), stabilizują ją wiązania wodorowe (oddziaływania bliskiego zasięgu), między –C=O….H-N–.

1. α-helisy

2. β-fałdowa (harmonijka)

1. Struktura III-rzędowa:

1. Struktura naddrugorzędowa – uporządkowanie przyległych do siebie krótkich fragmentów polipeptydowych o określonej strukturze II-rzędowej (fałdy Rosmana, β-kanapka, struktura klucza greckiego, palca cynkowego, szpilki do włosów).

2. Domena białkowa – większy odcinek łańcucha wyodrębniony w samodzielną strukturę przestrzenna. Obok domen strukturalnych są też funkcjonalne.

3. Białko globularne – konformacja cząsteczki jako całości, połączone ze sobą wiązaniami hydrofobowymi, czasem elektrostatycznymi, nie są to nigdy wiązania kowalencyjne.

Utrzymywana jest wiązaniami wodorowymi, elektrostatycznymi oraz wiązaniami hydrofobowe i oddziaływaniami van der Vaalsa

1. Agregat białkowy – odpowiednik struktury IV-rzędowej. W enzymach multimerycznych wyróżniamy tzw. właściwe enzymy oligomeryczne zbudowane z podjednostek o takiej samej funkcji. Są również kompleksy dienzymowe, które katalizują ciąg reakcji, poszczególne podjednostki wykazują różną aktywność.

Jednostka peptydowa, 4 atomy biorące udział w tworzeniu wiązania peptydowego

Wykład 3

18.10.2010

Aminokwasy łącza się wiązaniem peptydowym. Wiązanie peptydowe jest mocnym wnizaniem, ponieważ następuje rotacja miedzy węglem karbonylowym i tlenem i azotem a wodorem. Rotacja wynika z delokalizacji elektronów azotu i tlenie, a także istnieniem wolnej pary elektronów przy azocie.

Stabilizacja struktur białkowych:

1. Struktura II-rz:

• Wiązania wodorowe –C=O….H-N–

• Siły van der Waalsa

1. Struktury białkowe wyższego rzędu:

• Oddziaływania hydrofobowe (powstają pomiędzy resztami aminokwasów hydrofobowych).

• Wiązania wodorowe (inne niż w strukturze II-rz).

• Mostki solne (wiązania jonowe).

• Mostki di siarczkowe (reszty cysteiny) – powstają po zakończeniu syntezy łańcucha peptydowego, są katalizowane przez odpowiednie enzymy.

Wszystkie te wiązania oprócz mostków di siarczkowych są słabymi oddziaływaniami – łatwo je zaburzyć.

α –helisa

Jest to heliakalne (śrubowe) zwinięcie łańcucha polipeptydowego, utrzymywane jest przez wiązania wodorowe, powstają co 4 reszty aminokwasowe. Mostki wodorowe są równoległe do osi długiej helisy (faktycznie są nieco odchylone). α-helisę zaburzają niektóre aminokwasy np.reszty proliny. Bardzo często reszty aminokwasów w α-helisie układają się w taki sposób, ze ta helisa ma charakter ampifatycznny tzn. reszty aminokwasów hydrofobowych znajdują się po jednej stronie helisy, a hydrofilowe po drugiej stronie α-helisy lub β-harmonijki. Najczęściej odcinki heliakalne są nieco zdeformowane.

β-harmonijka

Jest znacznie częściej spotykana w białkach enzymatycznych. Tworzona jest przez fragmenty łańcucha polipeptydowego oddalone od siebie. Mogą być ułożone równolegle, lub antyrównolegle. Łańcuchy są odwrotnie do siebie ułożony. Jeżeli harmonijka ma charakter przeciwrównoległy to wiązania wodorowe powstające między grupa aminowa i karbonylowa są nieco odchyłowe od drugiej osi struktury β. Dla struktury równoległej fragmenty łańcucha polipeptydowego są położone są w tym samym kierunku. Bieg harmonijki: od N-końca do C-końca. Dla struktury antyrównoległej pętle łączące poszczególne odcinki uporządkowane są krótkie a dla struktury równoległej pętle są dłuższe. Pętle są elastyczne.

Jakie typy w III-rzedowej struktury odcinków o uporządkowanej strukturze II-rzędowej możemy wyróżnić:

1. α – nie stanowa więcej niż 50% całej cząsteczki białka, w białku globularnym występują tylko odcinki α-helikalne.

2. β – tylko odcinki fałdowe, nie więcej niż 50% łańcucha polipeptydowego.

3. α+β – w większości struktury α i β nie są przemieszczone.

4. α/β – odcinki są w większości przemieszczone.

W strukturze enzymów występują w większości 3 ostatnie.

Jak mogą być te segmenty rozlokowane w cząsteczce białka:

Pętle są elastyczne ale nie na tyle że całkiem dowolna jest ich struktura,. Mogą się zmieniać w trakcie wykonywania swojej funkcji przez dane białko. W trakcie katalizy tworzenia kompleksu enzym-substrat, najbardziej zmienia się konformacja odcinków które maja charakter pętli.

Przykłady białek enzymatycznych o strukturze α /β i α +β:

• Lizozym – enzym należący do hydrolaza glikozydowych, rozkłada wiązania glikozydowe w ścianach komórek bakterii gram dodatnich. Występują tylko odcinki heliakalne. Są one na ogół dość krótkie 2,3 zwoje. W białkach enzymatycznych ten typ struktury występuje rzadko.

• Dysmutaza ponadtlenkowa – współdziała z jonami miedzi lub cynku. Dominuje strona β-fałdowa, połączona krótkimi lub znacznie dłuższymi pętlami.

Rodzaje struktur naddrugorzędowych:

• Β-meander – składa się z 3 odcinków β połączonego 2 pętlami

• Klucz grecki – składa się z 4 odcinków β połączonymi pętlami

• Podwójny klucz grecki – 5 struktur β połączonymi pętlami.

• Fałd Rossmana – 3 odcinków β-fałdowych i 2 odcinków helikalnych.

Struktura szpilki do włosów – krótka pętla i długa pętla ponieważ odcinki β-fałdowe są różnej długości.

Struktura α/β-8-beczułki – po rozwinięciu struktury otrzymamy 8 struktur helikalnych i 8 struktur fałdowych położonych naprzemiennie. Beczułka składa się z 2 warstw: zewnętrzna składa się z helis a wewnętrzna zbudowana jest z 2 odcinków fałdowych. Jest spotykana w licznych enzymach między innymi w izomerazie triozo fosforanowej. Takie struktury powstają ze względów energetycznych. Są bardziej stabilne, elastyczne. Mogą brać udział w katalizie enzymatycznej. W tym motywie bardzo często znajduje się centrum aktywne (w świetle beczułki). Substrat może wnikać do centrum aktywnego beczułki ponieważ jest światło.

Reduktaza – białko dwudomenowe – w obu występują struktury α i β, z tym, że w domenie większej dominuje struktura heliakalna.

Struktura α/ α -6-beczułki – o kształcie beczki, zarówno wewnętrzna i zewnętrzna warstwa zbudowana jest z odcinków α-helikalnych połączonych pętlami. Występują rzadko w białkach enzymatycznych.

Papaina – 2 domeny, między którymi znajduje się wolna przestrzeń kieszeni katalitycznej. Jest to proteinaza cysteinowa.

γ-krystalina – nie jest białkiem enzymatycznym, występuje w soczewce oka. Zbudowana z wyraźnie oddzielonych od siebie domen. Domeny w przypadku białek enzymatycznych różne funkcje.

Dehydrogenaza aldehydu 3-P-glicerynowego – struktura dwudomenowa.

Kinazy białkowe – enzymy, które do białek wprowadzają reszty kwasu ortofosforowego. Struktura dwudomenowa.

Struktura IV – rzędowa – struktura agregatu białkowego:

1. Właściwe enzymy oligomeryczne –zbudowane z podjednostek katalizujących tę samą reakcję. Często te enzymy zawierają podjednostki regulatorowe – regulują alktywnośc oligomeru. Odbywa się to na drodze allosterycznej: aktywacja lub inhibicja. Przykładami są: dehydrogenaza mleczanowa, epimeraza UDPG, fosfataza zasadowa (odszczepia reszty fosforanowe z monoestru fosforanowego), dehydrogenaza alkoholowa (utlenienie alkoholu do aldehydu), heksokinaza – wprowadza resztę fosforanową do glukozy), polimeraza. Są one parzysto merami – składają się z parzystej liczby podjednostek.

2. Kompleksy wieloenzymowe – każda podjednostka katalizuje inną reakcję. Cały kompleks katalizuje ciąg reakcji (szlak metaboliczny).

Wykład 4

25.10.2010

Kompleksy białkowe:

W syntezie kwasów tłuszczowych są zaangażowane:

• Kompleks karboksylazy acetylo-CoA

• Kompleks syntazy kwasów tłuszczowych (synteza kwasów tłuszczowych).

Synteza kwasów tłuszczowych odbywa się w cytozolu a jednostkami budulcowymi są reszty acetylowe – reszty dwuwęglowe. Powstają one w mitochondriach w procesie β-oksydacji kwasów tłuszczowych jak i w oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianów (ostatni etap glikolizy, w warunkach tlenowych). Reszty acetylowe mogą zostać spalone w Cyklu Krebsa ale też mogą być wykorzystane w biosyntezach np. biosynteza kwasów tłuszczowych. Niektóre reakcje tej biosyntezy są odwróceniem reakcji zachodzących w β oksydacji.

W syntezie zachodzą reakcje redukcji przy użyciu NADP. Reszta acetylowa nie jest dostatecznie aktywna by mogła być wykorzystana w syntezie, jej aktywacja polega na wprowadzeniu grupy karboksylowej – przeprowadzenie reszty acetylowej w manylowa – przekształcenie acetylo-CoA w manylo-CoA. Katalizuje ja karboksylaza acetyl-CoA. Jest to pierwszy kompleks wieloenzymowy uczestniczący w biosyntezie kwasów tłuszczowych. Karboksylaza CoA wykorzystuje jako koenzym biotynę, która jest koenzymem z grupy witamin B.

(wzór biotyny)

Częścią reaktywną jest część pierścieniowa składająca się z pierścienia tiofenowego połączonego z mocznikiem. Jest to koenzym wszystkich karbosksylaz z wyjątkiem Rubisco. Każda reakcja karboksylacji (prócz fotosyntezy) składa się z 2 etapów:

• Przyłączanie grupy karboksylowej w postaci jonów wodorowęglanowych do jednego z azotów biotyny z utworzeniem karboksybiotyny. Rozkłada się ATP do ADP + Pi.

reakcja

• Grupa karboksylowa zostaje przerzucona na substrat A. Jest to reakcja transkarboksylacji.

Reakcja jest bardziej skomplikowana:

• Są dwa etapy w pierwszym etapie:

  • ATP łączy się jonem wodorowęglanowym i dopiero w tej strukturze

  • Łączy się grupa karboksylowa do biotny.

• Etap katalizuje podjednostki o aktywności transkatalazy, następnie następuje przerzucenie grupy COO^- na resztę acetylową. Powstaje manolylo-CoA.

Malonylo-CoA jest znacznie bardziej aktywny i wprowadzenie grupy karboksylowej ułatwia łączenie się reszty acetylowej z resztą malonylową. Dwie reszty acetylowe są za słabe by enzym mógł je przyłączyć. Dlatego jest to łączenie z dekarboksylacją.

Regulacja aktywności Acetylo-CoA

Może występować w formie aktywnej i nieaktywnej.

W formie aktywnej musi zostać dołączona reszta fosforanowa pochodząca z ATP a enzym, który przeprowadza fosforylację karobksylazy acetylo-CoA jest kinaza acetylo-CoA. Odłączenie reszty fosforanowej katalizuje fosfataza acetylo-CoA. Dlaczego kinaza nazywa się zależna Kinazą od AMP – bo jest zależna od AMP. W formie nieaktywnej to stężenie malonylo-CoA spada. Aktywność tej kinazy reguluje poziom stężenia AMP w komórce. Aktywna jest wtedy kiedy to stężenie jest wysokie.

Kompleks jest regulowany na drodze allosterycznej. 2 metabolity w cyklu Krebsa: cytrynian i izocytrynian aktywują ten kompleks. Cytrynian gromadzi się wtedy kiedy komórka ma dostateczne stężenie ATP i ulega spowolnieniu w cyklu Krebsa. Inhibitorem kompleksu jest palmitylo-CoA wtedy kiedy jest wystarczające stężenie kwasów tłuszczowych i trzeba zwolnić karboksylację. Jest inhibitorem ponieważ kompleks ten syntezuje kwasy tłuszczowe o długości do 16 atomów węgla.

Jak zbudowane są karboksylazy (oprocz Rubisco)?

Zawierają zawsze 3 rodzaje podjednostek:

• Jedna podjednostka to jest tzw. BCCP (biotin carboxyl carier protein) – przenosząca grupy karboksylowe. W przypadku karboksylazy acetylo-CoA białko to występuje jako dimer.

• Podjednostki o aktywności karboksylazy biotyny. W przypadku karbokzylazy acetyloCoA występuje dimer o aktywności karboksylazy biotyny.

• Podjednostki o aktywności transkarboksylazy. W przypadku karboksylazy acetylo-CoA te podjednostki występują w formie tetrameru.

We wszystkich karboksylazach biotyna związana jest kowalencyjnie z białkiem BCCP i w charakterystyczny sposób: łączy się poprzez swoja grupę karboksylową wiązaniem amidowym (z grupa 6-aminową reszty lizyny). (Wzór)

Reaktywna część biotyny znajduje się na końcu długiego ramienia molekularnego. W związku z tym biotyna może współdziałać z każdą podjednostką. Poprzez ramię molekularne może wprowadzać „główkę” do centrum aktywnego. W bardzo wielu kompleksach enzymowych występuje takie ramię molekularne. Również w syntazie kwasów tłuszczowych. Lizyna + biotyna = biocetyną.

Kompleks syntazy kwasów tłuszczowych

Synteza jest katalizowana przez wieloenzymatyczny kompleks (Procaryota) lub przez dimer białek wielodomenowych (Eucariota). Struktura syntazy kwasów tłuszczowych została zbadana dla enzymów Escherichia Coli.

Kompleks składa się z 6 podjednostek, które są białkami globularnymi. Podjednostka ACT (białko przenoszące reszty acylowe) jest białkiem pałeczkowatym, wydłużonym. W tej podjednostce ACP, występuje fosfopantoteina. Ma ona również charakter ramienia molekularnego, które ma długość 2nm. Centralna grupa tiolowa jest na kocu tego ramienia. Jest ona grupą czynną, do której dołączają się reszty acetylowe.

1. Transcylaza acylowa (AT)

2. Transcylaza malonylowa (MT)

3. Sytetaza 3-ketoacylowa (enzym kondensujący acylo-alonylo-ACP zawierający tiol peryferyjny) (CE)

4. Reduktaza 3-ketoacylo ACP sprzężona z NADPH (KR)

5. Dehydrataza 3-hydroksyacylowa (DH)

6. Reduktaza enoilo-ACP sprzężona z NADPH (ER)

7. ACP z fosfopantoteinazą

Występują wyraźnie ograniczone domeny i w domenach występują części o różnych aktywnościach. Dwie podjednostki tworzą funkcjonalny enzym.

W przypadku Eucaryota budowa jest nieco inna. Synteza składa się z 2 dużych podjednostek wielodomenowych. W każdej domenie występują części o różnych aktywnościach. Struktura wielodomenowa jest korzystniejsza energetycznie.

Substratami są reszta malonylowa i reszta acetylowa. Do tiolu peryferyjnego przyłącza się reszta acetylowa a do tiolu centralnego zostaje przyłączona reszta malonylowa. W kolejnej reakcji katalizowany przez enzym kondensujący; następuje przerzucenie reszty acetylowej z tiolu peryferyjnego na tiol centralny z jednoczesną dekarboksylacja. W kolejnej reakcji następuje redukcja i powstaje reszta 3-hydroksyacylowa. Reakcje katalizuje reduktaza 3-acyloketonowa. W następnym etapie następuje odczepienie cząsteczki wody. W kolejnej reakcji katalizowana przez reduktazę enoilową zostają przyłączone 2 atomy wodoru i już tiolem centralnym jest wiązana reszta butyrylowa. Dalej następuje przerzucenie reszty acylowej na tiol peryferyjny i do tiolu centralnego przyłącza się kolejna reszta malonylowa. Dalej zachodzą te same reakcje. Tak do momentu aż reszta acylowa zostanie wydłużona do reszty 16 węglowej – palmitynowej wówczas jest potrzebny enzym tioesteraza która odczepia kwas palmitynowy i dalsze wydłużanie odbywa się w innym kompleksie. Wprowadzanie wiązań podwójnych jest katalizowane za pomocą desaturaz.

Na tej zasadzie otrzymuje się nasycone kwasy tłuszczowe. Desaturazy wprowadzają wiązanie podwójne (nienasycone kwasy tłuszczowe).

WYKŁAD 5

8.11.2010

W zależności od organizmu gotowa synteza kwasów tłuszczowych składa się z różnych ilości podjednostek o charakterze domenenowym. W enzymie z drożdży występuje po 6 podjednostek. Jest to stosunkowo duży enzym, występuje dużo białka przenoszącego reszty acylowe i zawiera fosfopantoteinę.

W jaki sposób są transportowane reszty acetylowe z mitochondriom do cytozolu?

Reszty acetylowe pochodzą z β oksydacji kwasów tłuszczowych, pewne ilości (niewielkie) także z reakcji deaminacji i utleniania aminokwasów pochodzącego z trawienia białek, największe ilości pochodzą z rozkładu węglowodanów z glikolizy, która w warunkach tlenowych kończy się oksydacyjną dekarboksylacją.

Oksydacyjna dekarboksylacja zachodzi w macierzy mitochondrialnej. Reszty acetylowe stanowią substrat dla cyklu kwasu cytrynowego- Krebsa, a w błonie wewnętrznej mitochondrialnej zlokalizowane są jednostki oddechowe łańcucha oddechowego.

Reszty acetylowe muszą być przetransportowane do cytozolu, z tym ze acetylo-CoA nie może przechodzić przez błonę mitochondrialną, bo ona go nie przepuszcza, przez co, musi zostać przekształcony w związek, który przechodzi przez błonę – cytrynian.

Cytozol Mitochondrium

Reszty acetylowe są przekształcane za pomocą cytrynianu, w reakcji katalizowanej przez syntetazę cytrynianową w cytrynian. Cytrynian może przez błonę swobodnie wędrować do cytozolu. W cytozolu inny enzym – liaza cytrynianowa – rozkłada cytrynian na szczawiooctan, natomiast odszczepia od cytrynianu resztę acetylową, którą przyłącza do CoA. Musi zostać dostarczona energia, i tej energii dostarcza rozkład ATP do ADP. Reszty acetylowi są wykorzystywane do biosyntezy kwasów tłuszczowych, ale szczawiooctan musi powrotem trafić do macierzy mitochodrialnej, by cykl Krebsa mógł zajść. Spadek octanu oznacza zahamowanie cyklu Krebsa. Błona mitochondrialna nie jest przepuszczalna do szczawiooctanu, ale przez błonę może migrować pirogronian.

Po stronie cytozolowej, następuje reakcja przekształcania szczawiooctanu do pirogronianiu. w pierwszej reakcji następuje redukcja szczawiooctanu do L-jabłczanu katalizowanej przez dehydrogenazę jabłczanową (cytoplazmatyczną) sprzężoną z NAD. Jest to reakcja odwrotna do tej która zachodzi w cyklu Krebsa. W kolejnej reakcji działa enzym jabłczanowy, jest to pewna odmiana dehydrogenazy jabłczanowej mającej zdolność dekarboksylacji z równoczesnym utlenieniem substratu jakim jest jabłczan. Następnie zachodzi dekarboksylacja i utlenienie, z tym enzymem jest sprzężony NADP, powstaje pirogronian, który może przejść przez błonę mitochondrialna do wnętrza mitochondriów i tam jest karboksylowany przez karboksylazę pirogronianową sprzężoną z biotyna.

Cały ten transport reszty acetylowej z mitochondriom do cytozolu i przerzucenie pirogronianu do mitochondriom nazywa się czółenkiem cytrynianowym. Żeby nie dopuścić do spontanicznej dekarboksylacji następuje przekształcenie szczawiooctanu w dwóch reakcjach.

Dlaczego? Gdyby nie było procesu, nie powstałaby cząsteczka NADPH₂ potrzebnego do syntezy kwasów tłuszczowych. Pochodzi ona częściowo z czółenka cytrynianowego i częściowo z cyklu pentozowego.

Kompleks dehydrogenazy pirograonianowej – przekształcającej pirogronian w resztę acetylowi, działający w macierzy mitohondrialnej.

Jest to komplet wieloenzymatyczny dość złożony. Ma masę 4,6 mln Da. Katalizuje reakcję:

Dehydrogenaza pirogronianowa składa się z 3 rodzajów podjednostek:

• Dehydrogenaza pirogronianowa (dekarboksylaza) –wykazuje aktywność dekarboksylazy. Grupa czynna podjednostki E1 jest pirofosforan tiaminy – aktywna forma Wit B1

• Acetylotransferaza dihydrolipoamidowa – typ podjednostek E2, stanowią one rdzeń całego kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej i każda taka podjednostka zawiera kwas liponowy – 2 cząsteczki , które jest połączone poprzez swoja grupę karboksylową wiązaniem amidowym z reszta lizyny występująca w centrum aktywnym tych podjednostek E2.

• Dehydrogenaza dihydrolipoamidowa – typ podjednostek E3, są one sprzężone z FAD, i dodatkowo występuje w nich również NAD, liponoamid przenoszący resztę acetylowa z TPP na CoA - przechodzi z formy utlenionej w formę zredukowaną.

Kwas pirogronowy ulega przyłączeniu do pirofosforanu tiaminy, w tym połączeniu ulega dekarboksylacji i powstaje tzw. aktywny aldehyd octowy związany z TPB, skąd zostaje z udziałem liponoamidou przerzucony na CoA, wpierw przyłącza się do liponoamidu, potem powstaje acetylo-CoA. Liponoamid musi wrócić do formy utlenionej, Bierze w tym udział podjednostka E3. Atomy z FAD przerzucone są na NAD który się redukuje i powstaje NADH₂.

Regulacja aktywności kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej

Podjednostki są ze sobą połączone kowalencyjne i aktywność regulowana jest przez regulacje aktywności pierwszego enzymu – dekarobksylazy pirogronianowej.

Enzym jest w formie ufosforylowanej (fosforylacja katalizowana przez kinazę sprzężona z ATP przenoszącą resztę kwasu fosforowego z ATP na jedną z reszt seryny z dehydrogenazy pirogronianowej). Aktywacja zachodzi przez defosforylacje katalizowana przez fosfatazę. Fosfataza jest aktywowana przez jony wapniowe. Natomiast kinaza jest aktywowana przez acetylo-CoA jak również cytrynylo-CoA, oraz przez wzrost stężenia zredukowanego NAD (jeżeli stosunek NADH/NAD jest większy od jedności to kinaza jest aktywowana i unieczynnia kompleks dehydrogenazy. Jeżeli ten stosunek jest mniejszy od jedności to następuje zahamowanie działania kinazy i cały kompleks aktywuje się. W kompleksie występują dodatkowe podjednostki: kinazy i fosfatazy. Są to podjednostki regulatorowe.

Niedobór dehydrogenazy pirogronianowej najczęściej występuje:

• U dzieci,

• Wykazują one wysoki poziom kwasu mlekowego, pirogroniaonu i alaniny

• Powoduje on rozległe defekty neurologiczne i w efekcie śmierci.

Metody izolacji i oczyszczania enzymów

Tok postępowania jest inny jeżeli mamy do czynienia z enzymem zewnątrzkomórkowym i wewnątrz komórkowym

Dla zewnątrz komórkowego enzymu jest łatwiej izolować bo nie trzeba Niszczyc komórki. Dla enzymu wewnątrz komórkowych musimy zniszczyć strukturę komórkowa.

Jakie metody się stosuje w niszczeniu struktury komórkowej:

1. Metody o charakterze fizycznym

   1. Mechaniczne rozcieranie -niszczenie ścian komórkowych, błon cytoplazmatycznych (znacznie łatwiej zdezintegrować komórki zwierzęce niż prokariotyczne (drobnoustrojowe) roślinne. Najtrudniej dezintegrować tkanki roślinne przede wszystkim zdrewniałe.

   2. Wielokrotne zarażanie i rozmrażanie zawiesiny komórek, tkanek – szybkie zamrażanie w niskich temperaturach i powolne rozmrażanie. Wstępnie rozdrobniona tkankę w odpowiednim buforze umieszcza się w mieszaninie chłodzącej (suchy lód i alkohol, aceton). Następuje bardzo szybkie wyrażanie wody wewnątrzkomórkowej, tworzenie dużych kryształków lodu. Następuje rozsadzeni mechaniczne bariery błony cytoplazmatycznej i ściany komórkowej przez zwiększanie się objętości wnętrza komórki na skutek powstawaniu kryształów lodu. W trakcie powolnego rozmarzania w temperaturze pokojowej, treść komórki przechodzi do roztworu. Stosuje się również w przypadku homogenizacji komórek drobnoustrojowych prasy bakteryjne. Taka zamrożona zawiesina przeciska się przez szczelinę o określonej średnicy w stalowym cylindrze, przy dużym ciśnieniu.

2. Metody chemiczne

   1. Enzymy – dla bakterii gram dodatnich można Niszczyc polisacharydowe komponenty błony stosując lizozym. Proteinaza K, Proteinaza serynowa.

   2. Ułatwia zniszczenie ściany komórkowej stosowanie detergentów powodujących zwiększenie przepuszczalności błon cytoplazmatycznych, stosuje się detergenty jonowe i niejonowe.

   3. Stosowanie acetonu do wymycia wody w niskiej temperaturze – wysuszenie.

Później stosuje się wstępne oczyszczenie ekstraktu, po to by zmniejszyć objętość takiego ekstraktu.

Rozdział mieszanin Biełek w oparciu o różnice w rozpuszczalności:

• frakcjonowane wysalanie solami nieorganicznymi (siarczan amonu, siarczan sodu, chlorek sodu),

• frakcjonowane wytrącanie rozpuszczalnikami organicznymi (etanol, aceton, izopropanol),

• frakcjonowane rozpuszczalnymi polimerami niejonowymi,

• termiczna denaturacja białek balastowych (gdy docelowy enzym jest termo stabilny),

• wytrącanie białek w punkcie izoelektrycznym,

• specyficzna sorpcja w nierozpuszczalnym substracie,

• krystalizacja.

Musimy oznaczać w kolejnych frakcjach białek aktywność interesującego nas enzymu i zawartość białka. Co jest wskaźnikiem właściwie dobranych metod izolacji białek:

• Musi w jak najwyższym stopniu rosnąć aktywność właściwa – aktywność wykazywana przez mg białka obecnego w danym roztworze. Miano aktywności właściwej jest jednostka enzymatyczna u/mg białka u= µmol x min⁺¹.

• Aktywność ogólna każdej kolejnej frakcji powinna jak najmniej spadać. Powinna się zmniejszać ilość białe balastowych a rosnąć ilość ogólnego białka oczyszczanego.

• Aktywność ogólna powinna być wartością stała i określoną do danej reakcji.

Metody oznaczania

Metody chromatograficzne:

• sączenie na sitach molekularnych

• chromatografia jonowymienna na nośnikach naturalnych i syntetycznych

• chromatografia adsorpcyjna

• chromatografia powinowactwa biologicznego (swoista sorpcja) – nośniki w których występują specyficzne ligandy: analogi substratów, analogi koenzymów Ew same koenzymy, inhibtory enzymów (kompetencyjne), im bardziej specyficzny ligand do enzymy tym lepszy rezultat oczyszczania.

• chromatografia metalopowinowactwa – kolumny z jonami niklowymi, do jonów niklowych wykazują wysokie powinowactwo reszty histydyny, oczyszcz się białka rekombinowane (otrzymane w wyniku ekspresji tych białek jakimś gospodarzu – modyfikuje się te białka na 3’ i 5’ dokładając metkę histydynową). Produkowane białko będzie się wybiórczo wiązać na kolumnie niklowej.

• chromatografia hydrofobowa - w oczyszczaniu enzymów białek błonowych

• chromatografia kowalencyjna – oparta na tworzeniu mostków disarczkowych miedzy podłożem a białkiem

Metody immunochemiczne- oddziaływanie antygen – swoiste przeciwciało. Jest to metoda specyficznej sorpcji.

Wykład 6

15.11.2010

Metody chromatograficzne szczegółowe wyjaśnienie

Czym musi charakteryzować się dobry nośnik?

• Bierne (nie oddziałujące niespecyficznie),

• Nieściśliwe (nie zbijające się podczas zwiększania prędkości przepływu),

• Stabilne chemicznie,

• Posiadające regularny, kulisty kształt (ułatwiający przepływ),

• Porowate (duże rozwinięcie powierzchni i ułatwienie przepływu cząsteczek).

Materiały wypełnień w przemysłowej chromatografii preparatywnej:

• Usieciowany dekstran (Sephandex),

• Celuloza (Whatman TM, Cellufine, Sephacel, Cellex),

• Agaroza (Sepharose, Sepharose CL, fast flow Speharose),

• Sieciowany poliakrylamid (BioGel P),

• Kompozyd poliakrylamidu I dekstran (Sephacryl),

• Żel krzemionkowy i agarowa (Macrosorb KA),

• Polimery hydroksyakrylowe (Trisacryl),

• Silikażel (Sepherosil, Accel),

• Polistyren i di winylobenzen (Poros).

Wielkość od G-10 do G-200. G – informuje jak dużo wody wchłonie preparat. Liczby oznaczają ile gramów wody wchłonie 1 g Sephadexu (200 – 200g wody, 10 – 10g wody).

Kolumnę wypełnia się nośnikiem odpowietrzonym, by nośnik upakował się w kolumnie. Przemywa się eluentem. Dopiero potem nanosi się próbkę w niewielkiej objętości, w niewiększej od 5-10% w zerowej kolumnie (objętość cieczy między ziarnami w nośniku), by uzyskać dobry rozdział.

Na czym polega zasada rozdziału?

Małe cząsteczki, mniejsze niż średnica por w ziarnach, wnikają do wnętrza ziaren i ich przepływ w kolumnie się zmniejsza. Swobodnie będą przepływać przez kolumnę takie substancje o większej średnicy niż ziarna. Pierwsze pojawią się w eluacie. Rozdział na zasadzie opóźniania przepływu. Zbierając te same objętości eluatu w kolejnych frakcjach możemy stwierdzić, w których frakcjach występuje białko. Mierzymy Absorbancję przy 280 nm, która jest miarą zawartości białka w próbie.

Uzyskane wyniki przedstawimy w formie wykresu. Łączymy frakcje wykazujące aktywności i oznaczamy aktywność.

Techniki chromatograficzne:

Rodzaj chromatografii	Mechanizm rozdziału
Size-exclusion (filtracja żelowa) -efektywna dla małych objętości	Wielkość i kształt cząsteczek
Jonowymienna (Ion-exchange)	Ładunek jonów (kationity i anionity) – oparta na stosowaniu wymieniaczy jonowych, stosowana do próbek o różnej wielkość
Hydrofobowa (hydrophobic interaction chromatography)	Hydrofobowość – analogiczna do chromatografii z odwróconymi fazami, oddziaływania miedzy ugrupowoniaminu hydrofobowymi, wymywami przez obniżenia polarności eluentu, podniesienie temperatury, zmniejszenie zawartości soli
Affinity chromatography	Rozpoznanie molekularne – efektywna dla małych objętości
Immobilized metal-ion affinity – chromatografia powinowactwa	Kompleksowanie metalu
Covalent chromatography – chromatografia kowalencyjna	Zawartość grup –SH (tiolowych), redukcja wiązań di siarczkowych można wyprzeć dane białko z kolumny

Podział metod oznaczania aktywności enzymów:

1. Spektrofotometryczne – musi nastąpić zmiana maksimum absorbancji lub jego pojawienie się wynikające z tego, że został przemieniony substrat lub, że powstał określony produkt reakcji.

2. Fluorymetryczne – w wyniki reakcji powstaje fluorescencji.

Na każdym etapie oczyszczania oznacza się:

• Objętość

• Ilość białka

• Aktywność (właściwą i ogólną)

• Wydajność

• Stopień oczyszczenia

Wykład 7.

22.10.2010

Kryteria homogeniczności białek enzymatycznych

Uniwersalne kryterium nie istnieje. Czystość białka oceniamy na podstawie kryteriów cząstkowych:

1. Jednorodności chemicznej, określanej za pomocą następujących technik

   1. PAGE (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących i natywnych),

   2. IEF (ogniskowanie izoelektryczne),

   3. Analiza immunochemiczna.

2. Jednorodności katalitycznej (wykluczenie innych od docelowej aktywności w końcowym preparacie oczyszczonego białka).

3. Jednorodności molekularnej (liczba aminokwasów N- i C- końcowych, obraz sedymentacji podczas ultra wirowania, itp.).

Elektroforeza

Stosuje się żele od gęstości od 5-18%. Jest to mieszanina akryl amidu i bis-akrylamidu. Ich proporcje w mieszaninie tworzą żele o różnej gęstości. Przygotowuje się żel zatężający (5%) i rozwijający (5-18%). Przygotowany żel ze studzienkami wkłada się do kasetki, która wkłada się do komory elektroforetycznej, wlewa się odpowiedni bufor, na górę nakłada się pomocnicze statywy, mające za zadanie pomóc nanieść roztwór białka do studzienek. W miedzy czasie przygotowuje się roztwór białka. Zatęża się go na filtrach, by mniej więcej było stężenie białka 1 mg/ml. Do takiego białka, dodaje się bufor próbkowy zawierający SDS. Dodaje się barwnik (błękit demofenolowy), roztwór sacharozy lub glicerolu by białko nie wypłynęło. Nanosi się 5-10µl (max) do studzienki. Skrajne studzienki zostawia się wolne. Do jednej studzienki dodaje się wzorzec masowy (zestaw wiadomych białek o określonych masach cząsteczkowych). Całość zakrywa się pokrywą, ustawia się odpowiednie napięcie i natężenie i rozpoczyna się elektroforezę.

Białka przechodząc przez żel, zbijają się w wąski pasek. Wchodząc w żel rozwijający białka rozwijają siew względem masy cząsteczkowej. Najmniejsze cząsteczki białka wędrują szybciej. SDS (siarczan dodecylu sodu) – ma za zadanie denaturować białka tak by po jego odmyciu białka odzyskują konformacje, a także niweluje ładunek białka i nadając mu swój ładunek ujemny. Żel po wyjęciu jest przezroczysty. Trzeba żel wybarwić. Zatrzymuje się białka w żelu, a żel przenosi się do barwnika – błękitu kumazyny i pasma białkowe się barwią. Po wyjęciu cały żel jest niebieski z pasmami białek. Błękit odmywa się z żelu. Jeśli białka nie barwią się błękitem kumazyny to barwni się srebrem.

Określa się aktywność. Z żelu odmywamy SDS, przenosi się do mieszaniny roztworów która umożliwia przereagowanie wcześniej dodanej kazeiny z enzymem. Prowadzi się reakcje enzymatyczna. Kumazyna łączy się do kazeiny i pokazuje ile jej ubyło.

IEF – ogniskowanie izoelektryczne

Białka rozdzielają się po wartości punktu izoelektrycznego. Odpowiednio przygotowuje się żel poliakrylamidowy. Dodaje się amfoliny (małe polimery z wieloma ładunkami). Prowadzi się elektroforezę by amfoliny zmieściły się w żelu – gradient pH. Na tak przygotowany żel nanosi się mieszaninę białek. Białka migrują w żelu do momentu kiedy dojdą do wartości pH równej wartości punktu izoelektrycznego. Dodawany jest barwnik, po zakończeniu elektroforezy wybarwia się żel i otrzymuje się pasma białkowe.

Elektroforeza dwukierunkowa

Wykorzystuje wartość punktu izoelektrycznego i masy cząsteczkowej. Otrzymuje się pramki. Technika ta pozwala bardzo dokładnie rozdzielić białka, by wyciąć ją żelu i wyekstrahować i sekwencjonować.

Analiza immunochemiczna

Badane białko jest antygenem. Do mieszaniny przeciwciał dodaje się antygen. Zapewnia się odpowiednie warunki reakcji. Bada się odpowiednimi technikami, czy powstał kompleks antygen-przeciwciało. Metoda daje bardzo pewne wyniki.

Obraz sedymentacji podczas ultrawirowania

W probówce trzeba zrobić gradient stężenia (od 5-20% sacharozy) w wirówce. Na szczyt probówki nanosi się małą objętość badanego białka. Zamyka się próbówkę i wkłada się do rotora i zaczyna się ultrawirowania. Warunki uzyskuje się doświadczalnie i indywidualnie. Po zakończeniu wirowania, białka rozkładają się w gradiencie sacharozy w zależności od stałej sedymentacji. W probówce wstawia się kranik i frakcjonuje się zawartość probówki w zależności od frakcji. Bada się aktywność i stężenia białka każdej frakcji.

Oznaczanie aminokwasów N- i C-końcowych

Metody oznaczania:

1. Z FDNB (metoda Sangera) – 2,4-dinitrofluorobenzen – mając peptyd dodajemy FDNB w środowisku zasadowym, zachodzi reakcja między skrajną wolną grupą aminową a DNFB. Uwalnia się fluorowodór. Uwalniany jest rodnik DNP (2,4-dinitrofenylowy). Silnie się zakwasza środowisko reakcji (6M HCL) i następuje hydroliza wiązań peptydowych. Uwalnia się aminokwas i wszystkie wiązania peptydowe są degradowane.

2. Z fenyloizotiocyjanianem (metoda Edmana) – degradacja Edmana – odczynnikiem który jest wykorzystywany jest fenylotioizocyjanian, w środowisku lekko zasadowym, reaguje z wolna grupą aminową – znakuje ją . następuje odszczepiony jeden atom wodoru i cyjanian się w jego miejsce przyłącza. Powstaje fenylotriokarbanylowa pochodna tetrapeptydu. Zmieniamy na środowisko lekko kwaśne i w nim odszczepia się pochodna aminokwasu N-końcowego (PTH – 2-fenylo-2-tiohydantoinowa) bez degradacji pozostałych wiązań peptydowych – peptyd pomniejszony o 1 aminokwas. Można określić do 50 aminokwasó N-końcowych. Degradacja edmana – nie nastepuje tutaj degradacja całego łańcucha polipeptydowego, a jedynie 1 wiąznie piepetydowe. Dzieki czemu możemy cykl powtarzać. Potrzebne są bardzo małe ilości białka ^-12.

3. Z chlorkiem dansylu (dabsylu) (metoda Graya), - jest to reakcja kondensacji. Przyłacza się chlorek dansylu i powstaje pochodna dansylowa do której dodaje się 6M HCL następuje hydroliza wiązań peptydowych i powstaje pochodna dansylowa aminokwasu N-końcowego, w przypadku gdy działamy 6M HCL powstaje mieszanina aminokwasów. Uwalnia się ostatni aminokwas i nie następuje degradacja dalszych wiązań peptydowych. Nie jest to metoda bardzo wydajna.

4. Z chlorkiem dabsylu. Podobne do dansylowania, tylko zamiast chlorku dansylu jest chlorek dabsylu.

5. Z cyjanianem potasu (metoda Starka) – mamy tetra peptyd i środowisko kwasowe i w tym środowisku następuje sprzęganie tetrapeptyduy poprzez skarjna grupe aminowaa z cyjanianem potasu. Powstają tzw. Pochodne hydantoinowe aminokwasów. Następuje w środowisku kwaśnym następuje hydroliza wiazan peptydowyc i uwolnienie pochodnych hydantoinowych które analizuje się w Analizatorze aminokwasów.

Analiza aminokwasów C-końcowych

1. Metody enzymatyczne z wykorzystaniem:

   1. karboksypeptydazy A (odszczepia C-końcowe aminokwasy aromatyczne (Phe, Tyr, Trp, Leu) i duże reszty alifatycznych, izolowane z trzustki) -

   2. karboksypeptydazy B (odszczepia C-końcowe aminokwasy zasadowe(Lys, Arg, His)).

Badane białko denaturuje się kwasem nadmrówkowym, następnie do niego, dodaje się odpowiednia ilość karboksypeptydazy i inkubuje się przez określony czas. W czasie inkubacji co pewien czas pobiera się próbki mieszaniny reakcyjnej. Niezhydrolizowane białko wytrąca się kwasem trichlorooctowym, natomiast w roztworze pozostają uwolnione aminokwasy i taki roztwór nanosi się na analizator aminokwasów i otrzymujemy wynik poszczególnych aminokwasów. Znając kolejność próbek jesteśmy wstanie określić kolejność aminokwasów od C-końca.

1. Metoda chemiczna - hydrazynoliza białka. Odczynnikiem jest tutaj hydrazyna reakcje prowadzi się w podwyższonej temperaturze przy użyciu bezwodnej hydrazyny. Pod wpływem tych czynników następuje rozerwanie wiązań peptydowych z wytworzeniem hydrazydu wszystkich aminokwasów oprócz aminokwasu C-końcowego. Wolny aminokwas izoluje się z mieszaniny, lecz nie jest to metoda zbyt wydajna.

Metody wyznaczanie masy cząsteczkowej białek

1. Chemiczne

   1. Oznaczanie masy minimalnej –nie wykorzystywana.

   2. wyliczanie w oparciu o sekwencję aminokwasową białka, ustaloną na podstawie sekwencji genu – wykorzystywane wtedy kiedy znamy sekwencje naszego białka.

2. Fizykochemiczne

   1. Oznaczanie przez pomiar szybkości sedymentacji

M = (6500•S_20, w^O)^3/2- wzór empiryczny

1. Oznaczenie za pomocą sączenia molekularnego (na kolumnę nanosi się mieszaninę standardowych białek, mierzy się objętość elucyjną frakcji, wykreśla się krzywą wzorcową, potem na tą samą kolumnę nanieść roztwór białka i prowadzić sączenie w takich samych warunkach. Po otrzymaniu frakcji wyznaczamy objętość elucyjną i sprawdzamy jej wartość w oparciu o krzywą wzorcową).

2. Oznaczenie za pomocą SDS-PAGE - Białko z reszta cukrową ma możliwość przeciskania się przez żelu. Wpływa to na wynik. Wyznacza się współczynnik ruchliwości elektroforetycznej, by uniknąć błędu. Prowadzi się elektroforezę w żelu 6 i 12 % mierzy się odległości i oznacza się masę cząsteczkową z jednego i z drugiego żelu.

Wykład 8

29.11.2010

Określenie struktury I – rzędowej.

1. Tradycyjne – wykorzystuje się enzymy proteolityczne (Trypsyna i chemotrypsyna).

   1. Trypsyna potrafi hydrolizować wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszt aminokwasów zasadowych. Trypsyna jest endopeptydaza.

   2. chemotrypsyna – jej specyficzność jest podobna do karboksypeptydazy A, przy czym jest też ona endopeptydazo i hydrolizuje wiązania po karboksylowej stronie aminokwasów. W wyniku jej działania otrzymamy peptydy które będą miały na końcu aminokwasy: Trypsyna – Lys, Arg, His; Chymotrypsyna – Phe, Tyr, Trp, Leu.

   3. Czasami stosuje się subtiliznę – ma ona specyficzność substratowa jak chymotrypsyna, ale rozcina wiązania wolniej w aminokwasach aromatycznych.

Jak się to robi?

Do próbki białka dodaje się enzymy. Prowadzi się hydrolizę o trzymuje się peptydy o określonej długości i określonych aminokwasów C-końcowych. Taką mieszaninę peptydów poddaje się rozdziałowi na kolumnie chromatograficznej. Po oczyszczeniu taki peptyd poddaje się sekwencjonowaniu np. metoda Edmana. W wyniku tego otrzymujemy kilkatnasie kilkadziesaita peptydów o znanych sekwencjach. Jak mamy te peptydy, to dopasowywujemy sekwencje z obu próbek by odtworzyć łańcuch polipeptydowy.

1. Chemiczne

   1. Bromek cyjanogenu – rozrywa wiązanie peptydowe utworzone przez grupę karboksylową metioniny. Do reszty metioniny przyłącza się grupa cyjanowa, powstaje lakton homoseryny, w środowisku kwaśnym następuje hydroliza wiązania peptydowego, w obecności lakotnu homoseryny.

Proteom – określa się wszystkie białka które są produkowane przez organizm. Proteomika – nauka, której celem jest identyfikacja wszystkich białek proteomu danego organizmu. Uważa się, że organizm ludzki jest w stanie wytworzyć do około miliona różnych białek. Z tego też trzeba szukać innych metoda określanie proteomu. Jedna z nich jest technika określani widm masowych peptydów.

Próbkę badanego białka traktuje się enzymami proteolitycznymi (trypsyna, chymotrypsyna). Otrzymujemy mieszaninę peptydów o określonej długości. Trzeba je rozdzielić i oczyścić, poszczególne peptydy określa się za pomocą spektrometrii masowej – odkreśla się widma masowe peptydów, przy czym każdy peptyd ma określone swoje widmo. Potem porównuje się widmo potrzymanego białka z bazą danych. Na podstawie wysokiej homologii sekwencji z sekwencjami bazowymi wybiera się te podobne i na tej podstawie określa się sekwencję białka. W PDB umieszczone są sekwencjonowane białka. Mają znana również strukturę III-rzędową. Mając określone nasze białko, porównujemy do białka z bazy danych.

Od genu białka do białka

1. Znajdowanie genu:

   1. Synteza starteru - przygotowanie fragmentów starteru na podstawie sekwencji

   2. Bibliotekę fragmentów genomowego DNA. – wykorzystuje się tutaj DNA szczepu który produkuje badany przez nas enzym, po wyizolowaniu DNA tnie się na przypadkowe fragmenty i wprowadza się je do określonych plazmidów dzięki czemu tworzy się bibliotekę fragmentów DNA. Następnie te fragmenty z tej biblioteki wprowadza się do innych plazmidów tworząc wektory i tymi wektorami transportuje się odpowiednio przygotowane komórki gospodarza. Po transformacji komórki wysiewa się na podłożu i obserwuje się kolonie. Kolonie niebieskie to te które przyjęły wektor i u których przyjęte DNA uległo ekspresji, w tym fragmencie był gen psychrofilnej β-galaktozydazy. Ten konkrety fragment Dna poddaje się sekwencjonowaniu i szuka się w nim otwartej ramki odczytu.

2. Na podstawie sekwencji możemy przygotować prawdopodobna sekwencje aminokwasów badanych w przez nas enzymie (strukturę I-rzędową). Znając masę cząsteczkową jesteśmy wstanie porównać z masą cząsteczkową z prawdopodobnej sekwencji aminokwasów.

3. Taka sekwencje aminokwasową wprowadza się do programu PSI-BLAST, BLAST. Wprowadza się po to by uliniowić sekwencję. Są one po to by znaleźć sekwencje homologiczną do naszej. Na podstawie tych sekwencji wybiera się białko modelowe. Kryteria wyboru tego białka: stopień prawdopodobieństwa co najmniej 40%, a także musi być znana struktura przestrzenna określona na podstawie badań krystalograficznych. Wybieramy ten który został określony z wyższą rozdzielczością. Na podstawie tych 3 kryteriów wybiera się białko modelowe (szablonowe). Aby potwierdzić trafnośc białka szablonowego, sprawdza się jeszcze innymi dodatkowymi programami: BLAST P sequence-2sequence, Crystal X. Dlatego to się robi, by wyznaczyć ściśle określone regiony białka, szczególnie w centrum aktywnym.

4. Sprawdzanie modelu utworzonego białka. Chodzi o to by w pierwotnym modelu jest określona ilość wiązań o odpowiedniej długości, i wiele innych czynników i takie modele wysyła się do sprawdzenia na serwery dysponujące programami do sprawdzania. Otrzymuje się poprawiony model, poprawia aż do skutku.

5. Zoptymalizowany model poddaje się kolejnej weryfikacji programami: Verify 3D (Server Colorado), Prochek (mapa Ramachandrana ukazuje dozwolone konformacja łańcucha polipeptydowego, może służyć do wyzaczenia struktury alfa-helisy i β-faldowej). Takimi metodami możemy zmodelować strukturę białka – badania In silico –

Krystolografie rendgenoska i NMR,

Wykład 9

06.12.2010

Proces katalizy enzymatycznej, prowadzi do tego by liczba zderzeń pomiędzy enzymem a substratem była jak największa. Cząsteczka enzymu jest wielokrotnie większe od substratu. Po to by tak dużej cząsteczkę było odpowiednie sfałdowanie łańcucha polipeptydowego i by odtworzyć charakterystyczne miejsca w enzymie np. Centrum aktywne a także centrum allostyeryczne. W centrum allosterycznym wiąże się aktywator lub inhibitor, które zmieniają charakter enzymu, jego konformacje i aktywność. Enzymy maja specyficzna substratową i działania. Wynika to z ukształtowania centrum aktywnego (substratowa). Bardzo często mówi się, że enzymy są enancjoselektywne. Budowa chiralna.

Mechanizm reakcji katalitycznej

Reakcja enzymatyczna może zachodzić wg jednego z pięciu mechanizmów lub ich kombinacji. Bardzo często enzymy wykorzystują dwa mechanizmy reakcji. Przyspieszenie reakcji enzymatycznej dokonuje się poprzez:

1. Kataliza kwasowo-zasadowa – ten typ katalizy wymaga jednoczesnej obecności kwasu i zasady, przy czym jest to teoria kwasów Blanszteta (donory i akceptory wodoru), w układzie musza być obecne substancje które są donorami i akceptorami wodoru, właściwie donatorami i akceptorami protonu. Przyspieszenie reakcji następuje dzięki przeniesieniu protonów w układach reszt aminokwasów, które są zlokalizowane w centrum aktywnym enzymu. To są te reszty aminokwasowe które biorą udział w akcie katalitycznym. Przekształcenie substratu w produkt. Proces ten zachodzi w pH obojętnym. Aktywne reszty enzymu są biologicznymi ekwiwalentami, roztworu silnych kwasów (są donatorami protonów), czasami mogą być ekwiwalentem zasad. Bardzo często donatorem zasady (OH^-) jest cząsteczka wody.

2. Kataliza kowalencyjna – dwie definicje:

   1. W tego typu katalizie powstaje intermediat (związek przejściowy), który jest kowalencyjnie związany z enzymem. Jest to połączenie trwałe. Intermediat spełnia najważniejszą rolę w akcie katalizy. Ten typ katalizy szczególnie często jest wykorzystywany w enzymatycznym transferze, grup z donatora na akceptor. Rolę nukleofilów pełnia najczęściej grupy: -COO^- (Asp, Glu), -NH₂ (Lys, Arg), -CHOH (Ser, Thr), -C₆H₅OH (Tyr), -grupa imidazlowa (His), -Ch₂S- (Cys, Met).

   2. Łańcuchy boczne aminokwasy tworzące łańcuch polipeptydowy, zawierają szereg grup funkcyjnych, które mogą pełnić rolę nukleofilów, czyli donatorów elektronów, w reakcjach katalizowanych w centrum aktywnym. Obecny w CA enzymu, aktywny nukleofil, może atakować elektrofilowy fragment substratu, tworząc wiązanie chemiczne pomiędzy substratem a enzymem – nazywa się to kowalencyjnym produktem pośrednim (intermediat). Ten układ jest w następnym etapie reakcji atakowany przez niskocząsteczkowy nukleofil, którym jest cząsteczka wody.

3. Kataliza wewnątrz cząsteczkowa – w enzymie osiąga się ten efekt poprzez doprowadzenie do bezpośredniego kontaktu reagujących grup (następuje zbliżenie na odległość wiązania), oraz zapewnienie ich odpowiedniego stosunku molowego (bez nadmiarów i niedomiarów, 1:1), wówczas reakcja zachodzi praktycznie wewnątrz jednej cząsteczki, czyli kompleksu enzym substrat.

4. Kataliza poprzez zmianę konformacji –aby przyspieszyć wewnatrzcząsteczkową reakcję reagujące grupy muszą się względem siebie usytuować optymalnie. Osiąga się to poprzez określoną konformację cząsteczki, czyli tzw. Katalityczny efekt sferyczny. Zostaje on osiągnięty w stanie tranzycji, w którym następuje zmniejszenie naprężeń w obrębie reagującej cząsteczki, czyli następuje relaksacja wiązań.

5. Kataliza z udziałem jonów metali – metale mogą pełnić następujące funkcje

   1. Mogą brać bezpośredni udział w reakcji i tak się dzieje w przypadku właściwych metalo-enzymów np. procesy erdoks

   2. mogą stabilizować konformacje enzymu (jony Ca, w amylazie, subtylizynie, tyrozynie),

   3. mogą brać udział w wiązaniu substratu

   4. mogą tworzyć kompleks s substrat (kinazy: ATP z jonami Mg),

   5. mogą usuwać produkt ze środowiska reakcji.

Enzymy proteolityczne - są to hydrolazy, dzielą się na egzo i endogenne. Hydroluzja wiązania peptydowe wewnątrz i na zwenatrz czasteczki. Ze względu na fukanej biologiczne i zastosowanie w przemyśle są bardzo ważne. Jest to bardzo duża grupa enzymów, występują we wszystkich organizmów żywych, wirusach. W przemyśle na wąską specyficzność działania. Stanowią około 60% rocznej produkcji enzymów na świcei. Przemysły: spożywczy, mleczasrki, garbastwao, detergenty. Jest bardzo trudno wpasować je w ogólny system klasyfikacji enzymów.

Dlatego przy klasyfikacji enzymów proteolitycznych uwzględnia się 3 główne kryteria:

1. Typ katalizowanej reakcji; (egzo i endopeptydazy) – w zależności od tego gdzie działają. Egzopeptydazy dzielimy na 2 grupy ze względu na N- i C- końce białka:

   1. Aminopeptydazy (N-Koniec),

   2. Karboksypeptydazy (C-koniec).

2. Naturę chemiczną Centrum Aktywnego enzymu. Rodziny:

   1. Proteinazy serynowe (kod S) w centrum aktywnym mają serynę.

   2. Proteinazy cysteinowe (kod C) w centrum aktywnym aktywna jest cysteina.

   3. Proteinazy aspartylowe (kod A) w centrum aktywnym jest aktywny kwas asparaginowy

   4. Metalo-proteinazy (kod M) w centrum aktywnym pełnia aktywna funkcje jony metali.

   5. Proteinazy treoninowe–(kod T) w centrum aktywnym jest reszta treoniny.

   6. Proteinazy nieznanego typu (kod U) – one mają niepoznany mechanizm działania.

3. Ewolucyjny związek ze strukturą.

Proteinaza = endopeptydaza

Proteinazy serynowe

- Wiemy sporo o strukturze molekularnej, specyficzności substratowej i znamy ogoleny mechanizm działania. Ta grupa enzymów jest bardzo duża. Cechą charakterystyczną jest to, że ich działanie zależy od bardzo reaktywnej reszty seryny. Jest ona konserwatywna, czy silnie zakonserwowana w łąćuchu polipeptydowym. Wykazano, ze we wszystkich tych enzymach, w otoczeniu aktywnej seryny jest bardoz charakterystyczny motyw: Gly-X_AA-Ser-Y_AAGly. Łączy jest podobieństwo mechanizmów reakcji .

Charakterystyka ogólna tych enzymów:

Obojętne w ph Alakaicznym, działajie w zakresie 7-11, wykazuja szeroką specyficzno,ść usbratową, po za hydroliza wiazanpeptywoay, hydrolizuja estrowe i wiązanie amidowe inne niż peptrydpowe. Puntk Izoelektryczny 4-6.Równolegle z ta klasyczna metoda klasyfikacji zaczela funckjonowac inna klasyfikacja: klan, rodzina, podrodzina. Ta klasyfikacja opiera się o 3 kryterium: ewolucyjne zwiażanie ze stryktura. Kryterium podziału enzymu na poszczególne rodziny? Przyjmuje się w to kryterium ułożenie aminokwasów w centrum katalitycznym. Rodziny zgrupowano w klany na podstawie podobieństwa struktur trójwymiarowych. Zaobsterowano, że różnice strukturalne miedzy klanami są bardzo duże. Dlatego uważa się, że wywadzas ię one z odrębnych typów. Każdy kaln oddzielnie ewoluował. Rodziny aczeto dzielić na podrodziny biorąc pod uwagę homologie sekwencji aminokwasów. Szeroko rozpowszechnine są z klanu SA, SB. Seryna należąca do klanu SA występuja wyłącznie struktury β-fałdowe, a w SB – wystepują struktury α-helisy i β-betafałdowe.

Ktalitycznie trada przeniesienia ładunky – kwas asparaginowy-histydyna- seryna- ten akt katalizy jest oparty na tej traizie. Nie wewszytkich proteinazach jest ta katalityczna triada. Enzymy które należą do SA, SB, SC rzeczywiście mają triadę w centrum aktywnym, ale klany te miedzy sobą różnią się kolejności ułożenia tych reszt w centrum katalitycznym. SA (His-Asp-Ser), SB (Asp-His-Ser), SC (Ser-Asp-His). W innych klanach mogą być: SE (Ser-Lys-Glu), SF (Ser-Lys), SG (Ser-His).

Enzymy chymnotrypsynopopdbne – zbliżone wnyzmy włąsciwosciani do chymotrypsyny

Trypsyna, elastaza, trombina, - enzymy trawienne, enzymy trzystkowe, enzymy które zalicza się do proteinas chymotrypsynopodobcyhc, zostały wyizolowane ze zwierząt.

Chymotrypsyna – enzym trawienny ssaków, prowadzi hydrolize białek w jeliscie cienkim, słada się 3 łancuchów polipeptydowych Połoczanach wiazaniami disairczkowycmi. Ma mase 25 kDa. Enzym powistaie w formie chymotrypsynogenu w formie nieaktywnej. Jest to proenzym. Jest syntetyzowana w trzustce. Składa się z 245 aminokwasów. Musi on zostać uczynniony. W pierwysz etamie działa chymotrypsyna, rozcinają miedzy 15-16 resta aminowkasówa rocian wiazanie peptydowe. Powstaje aktywne białko chymotrypsyna Pi. Chymotrypsyna caczna działac na inne czasteczki chymotrypsyny pi i wtym akcie nastepuje wyciecie 2 peptydów (1-13) i (149-245) i powstaje aktywna chymotrypsyna α składająca się 3 łańcuchów peptydowych połączonych wiazaniami disulfidowymi. W efekie proteolizy N-poniec łacuycha B przmeiszcza się do Westrza czasteczki i oddziaływuje z Asp 194 met 192 przemiszacz ais ena powierzche biąłka, a reszty 187m i 1093 rosuwaja się. Dizkei tym zmianow tworzy się miejsce wiążące substrat specyficznie względem Phe, Trp Tyr, oraz Met i Leu. Chymotrypsyna hydrolizuje łancych polipepdydówy po karboskylwoej strnie tych aminokwasów.

Budaw chymotrypsyny:

Dyża hydrofoba wneka – odowiada za specyficzność substratowa, 2 wnęki hydrofobowe 1 wiazaaca Fraget n_acylowy czasteczki substraty, 2 wiążaca fragment amidowy. Mała wnęka wiążą wodór α i ta wnęka determuniuje ze mogą być tutaj ziwazane tylko α-aminokwasy. Odpowiada ona za stereospecyficznośc substratu.

Jak poznawano mechanizm działania chymotrypsyny. Badanie mechanizmu reakcji jest trydna. Dlatego opracowano zestawy tzw. Susbgratów syntetycznych dla określonych enzymów proeteolitycnzych bazując na specyfiocznosci substratowej. Ws ubstratch syntetycznych wystepuje wiazanie estrowe i przyłączony jest inny związek np. octan p-nitrofenylu.

Mechanizm przebiega w 2 etapach. 1- octan łaczy się chymotrypsyną tworząc kompleks enzym substrat. Nastepuje rozerwanie wiązani estrowego. Powstaje pierwszy produkt p-nitrofenol, natomiast grupa acetylowi z estru łaczny się z enzymem poprzez wiazaeni kowalencyjne. Powstaje acetylo-enzym. Jest to ten tzw. Kowalencyjny intermediat. Pierwszy etap określa się : acylacją enzymu. W nastepnych etapie nastepuje deacylacja enzymu. Acetylo enzym jest atakowany prze czastezckę wody, nastepuje hydroliza wiazania i powstanie drugiego produku, czyli jonu octanowego i regeneracja enzymu. Drugo etap jest wolniejszy niż pierwszy. Intermediat jest na tyle stabilny, ze w odpowiednich warunkach można go wyizolowac i zbadac, dzieki czemyu poznano mechanizm działania tego enzymu i miejsce wiezana grypy acylowej. We wszysich proteinazach serynowych grypa acylowa łaczy się z atomem tlenu w z jedna jedyna reszty seryny obecnej w centryum kataliztycznyml. Zebny stwirdizc ze seryna jest tym aminokwasem korty jest opowiedzianym za akty katalizym to trzeba ja zablowkoac i psradzic czy działą czy nie. Odcczynik ktorey blokuje to DIFP (diizofluorofosforan). Inhibitor ten łączy się z tylko z jedna reszta seryny znjadujacej się w centrum ktatlitycznym. Reszta seryny jest najbardziej aktywna. Reakcja ta jest stosowana w laboratorium.

Wykład 10

13.12.2010

Histydyna 57 działa podobnie. Znakowana jest TPCK, analog substratu. Dlaczego przyjeto ten keton chlorometylotosylo-L-Phe. 1) bo lancuch boczny zapewnia ze ten związek związe się specyficznie z chymotrypsyna. Jest to grupa warunkująca specyficzność, powie aż łacnych wchodzi we wnwtke hydrofobową znajdującą się w centrum aktywnym chymotrypsyny. 2) grupa reakcytwna PCK jest – reaguje ona z atomen N łancucha bocznego histydyny. Alkiluje atom N.

Hynotrypsyna która związała TpCK jest nieaktywna. Ma zablokowane centrum aktywne.

Reakcja.

Konformacja katalityczna triady w chymotrypsynie.

Aktywnośc zależy od seryny (195). W awarynkach fisjologicznych grupa boczna serynya ch2oH jest na ogół nie aktywna. W centrum katalitycznym chymotrypsyna, seryna ta sasiaduje z histydyna (57). Obok histydyny znajduje się leżąca wewnątrz czasteczek białka grupa β-karboksylowa kwasu asparaginowego. Te 3 reszty aminokwasów stanowia trade. Jezei nei ma substratu o reszta histydyny wystepuje w formie nieuketonowanej. Gdy wchodzi syubstrat w centrum aktywne, to oroton z seryny przechodzi na histydyne. Mamy uprotonowan forme histydyny, a na tlenoie hydroksylowej seryny pojawia się laduynek ujemy. Atom tlwmu ma nadiar elektroów dzieki czaemu może prowadzic nukleofiulowy atak na cząsteczkę substratu. Grupa karboksylowa kwasu asparaginowego (102) stabilizuje tę powstała w stanie przejściowym dodatnio naładowaną resztę histydyny. Druga funkacj reszty kwasu asparaginowego jest zapewnienie odpowiedniej orientacji reszrty histydyny tak aby mogą przyłączyć proton z seryny.

Mechanizm działania proteinaz serynowych

1. Acylacja – czasteczka trypsyny i substrat w jej otoczeniu. Reakcja hydrolizy zaczyna się od ataku tlenu od grupy OH seryny, tkroa wczesniej oddala proton an reszte histydyny, na karbonylowy atom węgla hydrolizowane wiazania peptydowego. Wiazanie miedzy AT Ci O w grupie karbonylowej przekształca się w wiazanie pojedyncze, atom tlenu uzykuje ładunek ujemy. Jednoczesnie powstaje wiazanie tlenu seryny z węglem karbonylowym z hydrolizowanego wiazania peptydowego. Powstaje tetraedryczny związek przejściowy. Naładowany ujemnie atom tlenu nazywa się oksyanion. Czasami mowi się ze powstaje dziura oksyanionowa. Z uprotonowaej reszty histydyny nastepuje przekazanie protonu na atom N hydrolizowane wiazania peptydowego. Wiazanie zostaje rozerwane, aminowa czesc substratu wiaze się wiazaniem wodorowym z histydyna, a kwasowa czesc substaaru wiaze się wiazaniem estrowym z seryna. Wiazanie wodorowe miedzy czescia aminowa a histydyna bardzo szybko ulega rozerwaniu i zostaje uwolniony pierwszy produkt reakcji: peptyd z uwolniona grupą aminową. Po uwolnieniu te produktu, to co zostaje okreslane jest jako kowalencyjny przejsowcy komplekst acyloenzymu z wiazaniem kowalencyjnym.

2. Deacylacja – gdy nastepuje dysocjacja pierwszego produktu, w jego miejsca wchodzi czasteczka wody. Na początku reszta histydyny odciąga od wody proton wodorowy (jon wodorowy); powstaje grupa OH, która natychmiast atakuje karbonylowy atom węgla z grupy acetylowej. Powstaje tetraedryczny intermediat. Nastepue oddysocjowanie przez proton połacznyo z reszta imodazowlowa, jest on przekazywana na atom tlenu seryny, co powoduje rozpad wiazania i uwolnienie drugiego peptydu z wolna grupa karboksylową. Nastpeuje regeneracja enzymu. Otworzenie grupy ch2OH w serynie.

Mechanizm ten prezentuje 2 typy katalizy: kowalencyjnej i kwasowo-zasadowa.

Proteazy cysteinowe

W centrym katalitycznym tych enzymów wystepuje reakctywa reszta cysteiny. Ta reszta działa w sprzężeniu z reszta histydyny. Mamy tutaj doczenienia z diadą przeniesienia ładunku. Enzymy te SA ewolucyjnie starcszcze od proteinaz serynowych. Są inhibowane przez odczynniki, ktroę blokuja grupy SH z cysteiny. Najpopularniejszym inhibitorem jest związek określany pCMP (p-chlorortęciobenzoesan). Inhibicja nie jest inhibicją specyficzna jak w przypadku TPCB dla proteinaz serynowych. Deaktywuje wszystkie czaszeczki enzymu. Proteinazy te mają zwykle słabo kwasne optymalne ph działania. Do proteinaz cysteinowych zalicza się proteinazy roślinne takie jak: bromelaina (wystepuje w pniu i owocach ananasa, enzym który pomaga w trawienu białek), ficyna (wystepuje w soku fig), papaina (proteinaza lateksu – sok mleczny pnia drzewa Carica papaya. Enzym ten wykorzystywopany jest do tenderyzacji (zmiekczaniae) gorszych gatunków mies), katepsyny (wtystpeuja w lizosomach, najaktywniejsza katepsyna B). Proteiznazy cysteinowe maja szeroka specyficzność działania.

Mechanizm działania na podstawie papainy.

Papaina hydrolizuej wiazania peptydowe miedzy aminokwasami zasadowymi (glicyna, leucyna) a innym wolnym aminokwasem. W cetrum aktywnym papainy znajduje się reszta cysteiny (25), która stanowie odpowiednik seryny (195) w serynie. W sąsiedztwie tej cysteiny jest reszta histydyny. Łancuch ten ułątwia przebig reakcji, poniwwaz dizął jako akcepton protonow przez co zwieka nukleowosc grupy sulfhydrylowej cysteiny. Cysteina naładowana ujemne będzie łatwiej i szybciej hydrolizwoan wiazanie peptydowe. Mechanizm ten jest zbliżony do mechanizmu chymotrypsy.

Tworzy się acyloenzym z udziałem cysteiny. Jest tutaj kataliza kowalencyjna polaczona z kataliza kwasowo-zasadową.

1. Acylacja enzymu – nastepuen przeniesienie protony z grype sylhydrylowej cysteiny na mierscien imidazosotawy histydyny. Tworzy się anion tiolanowy, powstaje atom siarki ujemnie naładowany i to on atakuje karbonylowy atom wegla karbonylowa hydrolizowane wiazania peptydowego. Wioazanie wegal gup się karbonylowej przeksztala cw wiazanie pojedyncze, atom tlenu zyskuje ładunek ujemny i jednoczesnie tworzy się wiazanie miedzy tlenem a siarka (wiazanie tioestrowe). Powstaje tetreedryczny intermediat. Jest oksyanion i dziura oksyanionowa.

2. Deacylacja enzymu– przeniesienie protonu grupy imidazowoej na ato azotu hydrolizowanego wiazania peptydowego, nastepue hydroliza wiazania peptydowego. Czesc aminowa substaau wiaze się histydyna, a czest estrowea wiazaniem tioestrowym z cysteiną. Wiazanie wodorwe miedzy histydyna a czescia aminowa ulega szybkiej degracaj i uwalnia się produkt z wolna grupa aminowa, powstaje przejściowy kowalencyjny kompleks w postaci acyloenzymu, z wiazaniem tioestrowym. Do Ca wchodzi woda, reszta histyty odciąga proton z wody, powstaje grupa OH, która natychmiast aktakuje karbonylowy atom węgla grupa acetylowej połaczeone j z cystina z centrum aktywnego, powstaje tetreaesdycny związek przejscowoy. Nastepuje hydroliza wiazania tiostroweog i uwolnienie drugiego produktu reakcjia z wolna grupa karboksylowa i regeneracja enzymu.

Proteazy aspartylowwe

W Ca role aktywnym role katalizo watowa podgruywaja 2 reszt asparylu., Nie wystpeuja u prokariota, optymalne pH działania niższe niż 4. Ihibuje niespecyficznie pepstatyna. To oligopeptydy produkowany przez bakterie. Do proteaza aspartylowych należą: trymsyna, chymozyna (podpuszczka, wywatrzana w zoladkach cielata przez pierwsze miesiąca zycia. Działa specyficznie, rozcina jendo wiazanie w kappa kazeinie, co prowadzi do powstanie skrzepu (sernika) wykorzystywany do produkcji serów podpuszczanych. Odpowiednikiem tej podpuszczki jest gastrycyna, która wystpeuje w żołądku niemowląt). Do proteaz zalicza się podpuszczko podobne proeinzay pleśni ( Są najczęsćej pleśnie Apsergillus czy Penicillium, których optymalne pH działania wyności 3, 4. Mają zdolność do koagulacji mleka, czyli są stosowane w serowarstwie jako zamiennik podpuszczaki cielęcej). Zaliza się proteinazae HIV 1 (ma decydujące znaczenie dla jego replikacji. Najlepeij poznanym enzymem jest pepsyna. Produkowana przez śluzówkę zoładka jako pepsynogen (nieaktywna czesc enzymu), jej opylane pH to 1,9. Jest to podstawowoy enzym trawienny w soku żołądkowym. Hydrolizuje wiazania peptydowe w sąsiedztwie reszt (Phe, Tyr, Ile, Val, Leu). Pepsyna jest pojedynczym łańcuhem peptydowym o masie opk 35 kDa. W Ca pepsyny musza być 2 reszty kwasu asparaginowego (32, 215). Numery pokazuja mechanizm działania. Reszt leza po 2-óch strona czaseczki wody. Aby enzym był aktywny jedna reszta musi być zjoniowa a druga nie może być zjonizowana. Rola reszt kwasu asparaginowego, prowadzonej przep peppyse katalize wiazania peptydowego jest dwojakiego rodzaju:

1. Reszty aktywują znajdująca się miedzy nimi czasteczkę wody,

2. Działają jako donory i akcepytwy protonów.

W przypadku mechanizmu mamy doczyanienia z przykładem katalizy kwasowo-zasadowej. Rolę kluczowa w akcie katalizy oduywaja grypy β-karboksylowe znajdujące się w łańcuchach bocznych tych aminoiwkasów. Mechanizm reakcja proetizna aspartylowych jest inny, nie tworze się tutja acyloenzym. Nie ma katalizy kowalencyjnej. Jest tylko kataliza kwaso-zasadowa.

Mechanizm

1. Musza być 2 reszty kwasu aspartylowego. Zjonizowana reszta jest okreslana reszta 32 i ona obiera proton od czasteczki wody. Przez co umozliwia jej atak na węgiel karbonylowy hydrolizowanego wiazania peptydowego. Tworzyu się gr OH i ona atakuje wegiel karbonylwy. Jednoiczescie grupa karboksylowa lancy cha drugoieo amionowkasy 215 przekazuje proton na grupe karbonylową, na atom tlenu, tworzy się tetraedryczny oboje™ny produkt przejściowy. Do atomu wgla przylaczoane SA 2 gr hydroksylowe, grypa aminowe i reszta łąńcycha . Rozpad tego produktu zachodzi wg podobnego mechanizmu jak utworzenie, przy czym oba protony za przenoszone w odrwornym kei rynku. Resta kwasy aspa 32, Krota wczensiej obiera proton, oddaje teraz proton i ten proton jest przenoszony na grupę NH hydrolizowanego wiazania peptydowego, reszta kwasu ASP 215, z kojei przyjmuje proton z jednej z dr Oh produktu przejsciowegom, co powoduje utworzenie grupy karbonylowej. Efektem tych przemian jest zerwanie wiazanie peptydowego i utworzeni dwóch produktów reakcji, z ktroych jdne ma wolna grupa karboskyloa a drugi ma wolna grup® aminową ii odwarza się enzym w aktywnej formie.

Metaloproeazy.

Mechanizm działania α-amylazy

Został zapopoowany przez Mazura i współpracowników. Mechanizm hdyrolizyu wiazania α-1,4 glikozywdoeg w skrobi.

W reakcji uczesnicza 2 reszt kwasu asparaginowego (197, 300) oraz reszta wasu glutaminowego (233) i sprzężony z reszta kwasów asapraginoweg (197) łańcych przeniesienia protonu, k™óry w α-amylazie Krzystku wieprzowej objemuje: reszte Tyr(62) Asp (96), Arg (195). Z argininy proton jest przekazywany na katalityczna reszte kwasu apsaragiznowego (197). Enzym Taka-Amylaza, Aspergillus Oryzae, łancycj przeniesie protonu obejmuje his (296), Tyr, (82), wkas asparaginowy (117), Arg (204). Proton z argniny jest przenosony na kataliz tycz reszte kwasu asparagi (206). Łancuchy przenoszenia protnu rożna się dla α-amylaz. Łancych przenoszenia konczy się na argininie, a ta potem przekazuje na katalityczny kws asparaginowy.

Mechanizm

1. Przyłączenie czasteczki wody do katalitycznej reszty kwasu glutaminowego (233).

2. Nukleofiowy atak tlenu z wody na węgiel C1 rozsczepionego wiązani glikozydowego.

3. Protonacja cykliczego atomu tlenu w reszcie glukopiranozy z C1 rozsczepionego wiazania. Protn dostaczea łąncych prznoszeni protonu, który konczy się zawsze argininą. Dzięki 2 i 3 etapowi nastepune otwarcie piersciena glukapiranozy i pęka wiazanie hemiacetylowe. Do wegla C1 przylacz asie gr OH z wody, nastomiast wodór z czasteczki wody dołącza się do gr karboksylowej kwasu glutaminowgo 233, proton wodoru z argininy, łćżay się z tlenem rozczepia nowego wiazania hemiacetylowgo.

4. Nastepume obrót woól wiazanie C1-tlen glikozydowy i wokół wiazania tlen-C4 tego pierścienia. Prowadzi to do miany położenia grupy OH, przy weglu C1, dzieki zemu może on utworzyć, mostek wodorwy Z reszta kwasu asparaginowego 300. Powstały koniec jednego z produktów tworzy mostek wodorwy z kwasem glutamionaowy 233, przy węglu C1 drygiego produktu pojawia się grupa karbonylowa. Grupa karbonylowa powstała przy C1, atakuje nukleofilowa tlen który znajduje się przy weγlu C5 tej samej reszty. Prowadzi to do zamkniecia pierścienia glukopiranozy i oddania protonu z tej grupy C5 –OH na grupę karboksylową reszty kwasu asparaginowego 197. Nstpeuje uwopanienie obu proutków reakcji.

Mechanizm działania β-galaktozydaz

Są 2 hipotezy działania tego enzymu. Jest to enzym galaktohydrolaza β-D-galaktozydów. Enzym katalozuje hydrolize cukru mlecznego laktozy do glukozy i mannozy. Ponadto jest wstanie hydroizwac 4-O-β-galaktooligosacharydy. Njalepeuj poznay jest enzym z E.Coli, w akcie katalizy uczesnicza takie aminokwasy: reszty Kwasu glutaminowego 461, kt®óa jest zakwoticzoa w CA β-galaktozydza w pobliżu węgla reszty galaktozy substratu, połaćzonyje koordynajcyjknie z jonem Magnezu, reszta ta jest donorem i akceptorem protonu. Druga reszta kwasu glutamioniwego 537, kto®a jest oddalona o 3 angsztremy od anomerycznego wiegla galaktozy i spelnia rolę nukleofila.

Mechanizm laktozy wg Espinoza)

1. Enzym działa jako trans glikozydaza, katalizuje przeksztalenie laktozy to allolaktozy.

2. Hydroliza allolaktozy do glukozy i galaktozy z tym ze glukoza wydostaje się z Ca enzymu, a galaktoza pozostaje w CA.

3. Do związane j z enzymem reszty galgktozylowej, przyłącza się czasteczka wody, dzięki czemu nastuje uwolnienie czaszki galaktozy z Cetum katalitycznego enzymu.

Wykład 11

20.12.2010

Reszta tyrozyn – Tyr 503 znajduje się w pobliżu reszty Glu 537 – odległość równa wiązaniu wodorowemu, grupy OH z Tyr znajduje się blisko internukleotydowego tlenu w wiązaniu glikozydowym umożliwia jego protonacje.

Laktoza występuje w pewnym typie konformacji aby umożliwić zbliżenie grupy OH przy 6 atomie węgla glukozy do anomerycznego węgla galaktozy. To powoduje, że jest możliwe zajście transglikozylacji bez znacznych przesunięć w Centrum aktywnym.

Jurse i inni

Ten mechanizm nie przewiduje etapu transglikozylacji z wytworzeniem allolaktozy. Występują tu jony sodu (Na), mają uczestniczyć w wiązaniu substratu. Kompleks enzym-substrat przesuwa się wgłąb kieszeni katalitycznej – ma mniejsze oddziaływania między substratem a enzymem. Za substratem przesuwa się łańcuch boczny Phe oraz pętla łańcucha polipeptydowego. Taka pętla ogranicza dostęp do wytworzonego kompleksu. Tworzy się kowalencyjny kompleks enzym-galaktozy (Glu 537). Potem uwolnienie cząsteczki glukozy. Proces wymaga obecności kwasu (jony Mg lub Glu 451). Następuje przeniesienie związanej z glu 457 reszty galaktozydowej na cząsteczkę wody. Reszta Glu 457 zostaje zastąpiona w substracie przez cząsteczkę wody. Zmiany konformacyjne zachodzące w stanie tranzycji prowadzą do zmniejszenia oddziaływań gr. 6-OH z jonami Na. Dzięki temu następuje uwolnienie galaktozy z Centrum aktywnego enzymu.

To były 2 hipotezy na temat działania β-galaktozydazy. Obaj autorzy zgadzają się, że reszty Glu 537 i Glu 451 są niezbędne do zajścia reakcji (aktu katalitycznego). Są one silnie zakotwiczone w β-galaktozydazach różnego pochodzenia.

Metaloproteazy (Egzo- i endopeptydazy)

Enzymy, które w swoim Centrum aktywnym zawierają jako czynnik katalityczny jon metalu (zazwyczaj Zn). Związki, które inhibują działanie enzymów są związkami he latującymi np. kwas wersetowy – EDTA, fenantrolina. Jon metalu w Centrum aktywnym jest związany koordynacyjnie z ligandem (pH~7). Enzymy te wystęują u bakterii, grzybów, organizmów wyższych. Różnią się sekwencyjnie i strukturalnie. Łączy je obecność kationu Zn²⁺, jednak może być on zastąpiony innym jonem np. Co, Ni. Do metaloproteaz zalicza się:

• tkankowe kolagenozy kręgowców (substratem będzie kolagen) – tną tropokolagen na 2 frgamenty (3/4 długości i ¼ długości).

• Kolagenozy występujące u bakterii (Clostridium – występuje w jadzie kiełbasianym) – zdolność do znacznie głębszej hydrolizy kolagenu.

• Termo lizyna – enzym wyizolowany z bakterii termofilnych, posiada Zn²⁺, który jest związany z dwoma resztami His i jedną resztą Glu. Ligandem jest cząsteczka wody.

Wiele enzymów zawiera sekwencję:

His-Asp(Glu)-X-X-His

Najlepiej zbadaną metaloproteazą jest karboksypeptydaza A. Egzopeptydaza, która działa od końca. Enzym trawienny, hydrolizujący wiązanie peptydowe sąsiadujące. Reakcja zachodzi najszybciej, gdy C-końcowy aminokwas będzie aminokwasem aromatycznym lub aminokwasem z rozbudowanym łańcuchem bocznym. Enzym ten jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym. Ze zwartą cząsteczką wiąże się jon cynku, znajdujący się w zagłębieniu, blisko powierzchni cząsteczki, tworzy się wiązanie koordynacyjne z His, His, Glu, H₂O. Kieszeń katalityczna mieści w swoim wnętrzu aminokwasy aromatyczne i te z rozbudowanymi łańcuchami bocznymi.

Idukowane dopasowanie – substrat wiąże się z enzymem to w strukturze zachodzą liczne zmian. Aktywacja wody – jon Zn powoduje zwiększenie reaktywności cząsteczki wody.

Mechanizm katalizy

Gdy nie ma enzymu substraty są w pH stabilnym. Cząsteczka wody ma ograniczony wpływ na wiązanie peptydowe. Karboksypeptydaza A katalizuje cząsteczkę wody. Jest to możliwe dzięki obecności jonu Zn, który musi współpracować z resztą Glu 260. Powoduje to, że cząsteczka wody przekształci się w grupę karboksylową, która będzie mogła brać udział w akcie katalizy. Grupa OH atakuje grupę karbonylową hydrolizowanego wiązanie peptydowego – nukleofilowy atak. Kation wodoru przyłącza się do grupy karboksylowej Glu. Powstaje obdarzony ładunkiem tetraedryczny związek przejściowy (ma charakter kowalencyjny, występują wiązanie elektrostatyczne – z jonem Zn, łańcuchem bocznych Arg 127). Następnie zmiana konformacji, aby naprężyć hydrolizowane wiązanie peptydowe. Następuje przeniesienie protonów grupy karboksylowej Glu na grupę NH hydrolizowanego wiązania peptydowego. Co doprowadza do zerwania wiązania i uzyskania 2 produktów. Jeden ma wolną grupę aminową, drugi zaś wolną grupę karboksylową. Mechanizm jest jednoetapowy. Mamy tutaj do czynienia z deformacją cząsteczki enzymu, z tetraedrycznym związkiem przejściowym połączonym oddziaływaniem elektrostatycznym.

EKSREMOZYMY

Eksrtemofile:

• Hipertermofile (>80°C)

• Psychrofile (<15°C)

• Halofile (występuja w stężeniach soli 1,5-5,2M)

• Kserofile (aw<0,8)

• Radiofile (wysoki poziom radiacji)

• Endolity i Hipolity

• Piezo file (ciśnienie > 40MPa)

• Metalofile (wysokie stężenie metali ciężkich)

• Alkalifile (pH>9,0)

• Acidofile (pH<3,0)

Adaptacje drobnoustrojów do ekstremalnego środowiska:

• Specyficzne mechanizmy energii (bakterio rodopsyna halofili) oraz utrzymywania homeostazy metabolizmu i środowiska wewnątrzkomórkowego.

• Stabilność funkcjonalnych i strukturalnych komponentów komórki w warunkach ekstremalnego biotopu.

• Kinetyka reakcji biochemicznych dostosowania do warunków ekstremofilnych.

• Skład lipidów zapewniających płynność membran oraz właściwy transport jonów i biocząsteczek.

• Produkcja ochronnych egzopolimerów (np. egzopolisacharydów), biosurfaktantów, kompatybilnym sokutów.

• Tworzenie ochronnych barwników i i nnych molekularnych filtrów UV.

HIPERTERMOFILE

Występowanie:

• Obszary wulkaniczne i geotermalne (gejzery, fumarole, solfatary).

• Kanały i otwory hydrotermalne na dnie mórz.

• Gorące prądy morskie.

• Gorące hałdy miału węglowego.

• Ogrzewane geotermicznie złoża ropy i szyby wiernicze.

Podział:

1. Archeony (Pyrodictium occultum – 2h w 130°C; Pyrodobus fumari - 90-113°C; Nanoarcheum aquitans)

2. Bakterie (Thermus aquaticus – 50-85°C; Thermotaga maritima – 50-90°C; Methanococcus jarunaskii – T_opt = 85°C)

Adaptacje:

1. Produkcja białek opiekuńczych (białka szoku cieplnego HSP), zwiększających odporność komórek na denaturację cieplną, zapobiegającemu agregacji bialek i ułatwiających prawidłowe ich zwijanie.

2. Specyficzny skład lipidów błonowych – wzrost zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych, cyklicznych lipidów, redukcja rozgałęzień. U archeonów zamiast fosfolipidów występują zawierające wiązania eterowe archeole i kaldarcheole – pochodne glicerolu i fitolu lub bifitolu, 20-węglowych rozgałęzień alkoholu, w nono warstwie występują też lipidy C₄₀.

3. Termozymy – katalityczne białka adaptowane do wysokich temperatur.

4. Wzrost zawartości soli – np. potasu w cytoplazmie, obecność polasin – spadek stężenia wolnej wody, stabilizacja makromolekuł.

PSYCHROFILE

Występowanie:

• Zimne wody słodkie i morskie

• Lód lodowców

• Lód morski

• Podziemne jaskinie

• Polarne i wysokogórskie gleby

• Rowy oceaniczne, osady denne

• W chmurach: bakterie gram (+), gram (-); drożdże, grzyby strzępkowe

• Permafrost (wieczna zmarzlina)

Psychrofile (rosną 0 °C)

1. Psychrofile obligatoryjne = właściwe T_opt <15°C, T_min <20°C

2. Psychrofile fakultatywne = psychrotrofy T_opt <20°C, T_min <40°C

Wykład 12

3.1.2011

Specyficzne adaptacje organizmów zimnolubnych do bytowania w niskich temperaturach.

1. Specyficzny skład lipidów błonowych:

   1. Wzrost zawartości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych z rodzin n3 i n6, mononasyconych (izomery anteiso) i nienasyconych.

   2. Białka opiekuńcze (białka szoku zimna (CSP)i białka aklimatyzacji do zimna (CAP)).

   3. Produkcja psychrozymów o giętkich cząsteczkach.

   4. Produkcja białek nukloeacyjnych lodu (INP) – zarodki kryształów lodu.

2. Czynniki krwioproteksyjne (ekstremolity) (trehaloza, cholina, betainy).

3. Produkcja białek termicznej histerezy AFP.

ACYDOFILE

Mikroorganizmy które żyją w niskim pH. Występuja na kwaśnych obszarach geotermalnych, czy kwaśnych drenażach kopalnianych. Rosną najczęściej w pH <3. Zalicza się do nich bakterie siarkowe. Występują wśród acydofili archeony (Sulfolobus acidocaldaricus, Picrophilus torudus). Wystepuja również eukarionty (rośłiny i grzyby).

Adaptacje środowiskowe:

1. Maja dodatni ładunek na powierzchni komórki.

2. Produkują dodatkowe, ochronne otoczki komórkowe, które są nieprzepuszczalne dla protonów.

3. Zlokalizowane w ścianach komórkowych wydajne systemy eksportu protonów do środowiska. Systemy te nazywają się ATP zależne popmy protonowe.

Wszystkie przystosowanie mają na celu niedpouszczenie do dostaniw a się nadmiernej ilości protonów od komórki.

ALKALOFILE

Mikroorganizmy k™óre preferują wysoce zasadowe środowisko życią. Wystepuja w glebach któ®e są przesycone węglanami, wyługowanymi z minerałów. Występują na pustyniach sodowych i jeziorach sodowych np. w Indiach lub w USA. Alkalofile preferują pH>9. Wśród tej grupy mikrpooganisó wyróznianhmy bakterie i archeony. Część bakteri z rodzaju pseudomonas, microcooccus, corynae bakteriom, vi brio, flavobacterium. Bacillus firmuj pH 10.5. Archeony z grupy Natronobacterium.

Adaptacje:

1. Ujemny wypadkowy ładunek ściany komórkowej.

2. Lipidy błon cytoplazmatycznych tych mikroorganizmów są bogate w mononienasycone, nierozgałęzione kwasy tłuszczowe.

3. Wystęują tutaj membranowe pompy wodorowo-sodowe, które działają na zasadzie antyportu. Są one po to aby utrzymać obojętne pH cytoplazmy.

4. Gromadzenie w cytoplazmie poliamid. Przede wszystkim zasadowych aminokwasów (Lys, ARG, His), po to aby ułatwić buforowanie cytoplazmy w zasadowym środowisku.

HALOFILE

Mikroorganizmy które preferuja środowiska o dużym stężeniu soli. Poziom stężenia soli podaje się w odniesieniu do stężenia NaCl. Wystęują w słonych jeziorach np. w morzu martwym, przybrzeżnych salternach, solanki sodowych, mostach solnych i sztucznych zbiorniki w których otrzymuje się sól morską.

Wyróżnia się:

1. Umiarkowane halofile -1,0 – 3,5 M NaCl

2. Ekstramalne halofile 3,5-5,0 NaCl

Zalicza się bakterie: Acinetobacter, alteromonas, pseudomonas, vibrio. Do ekstremalnych halofili zalicza się archeony: halobaterium salina rum. Organizmy eukariotyczne – zielone glony (Dunaliella salina), Cyjanobakterii

Adaptacje:

1. Zdolnośc do akumulacji soli wewnątrz komórek.

2. Produkcja osmoaktywnych substancji (eksremolitów). Mogą nimi być: cukry, poliole, aminokwasy, ektoiny. Substancje te są produkowane w stężeniach izotonicznych w zgredem morko organizmu w środowisku w któ®ych wystepuje.

3. Produkcja pozakomórkowych polisacharydów i innych polimerów (kwasty poli-β-hydroksymasłowy, poli-γ-glutaminowy).

4. Synteza na wysokie stężenia soli białek.

5. Produkcja enzymów które wymagają obecności soli do działania. Są zdolne do wydajnego prowadzenia biokatalizy w środowiku wysokiego stężenia soli. Enzymy te zawieraja w swoich czasteczkach wiecej aminokwasó kwaśnych niż homologiczne białka mikroorganizmów nie będących ekstremo filami (mezofile).

6. Mają grubsza otoczkę solwatacyjna.

7. W haloarcheonach, stwierdzono obecność w cytoplazmie purpurowego barwnika – bakteriorodopsyny. Jest to nic innego jak pompa protonowa która porodukuje ATP i jest napędzana promieniowanie świetlnym.

PIEZOFILE

Mikroorganizmy potrafiące rosnąc przy cisnieniu do 140 mPa. Wystpeuja głównie w głębinach morskich (średnia głebokość 3,8 km), a także w szczelinach sklanych pod powierzchnia ziemi do długości do 3 km.

Wśród piezo fili wyróżnia się:

1. γ-proteobakterie

2. archeony

3. grzyby strzepokowe

Adaptacje:

1. muszą produkować makromolekuły odporne na ciśnienie, białka, polisacharydy, mogą znosić ciśnienie do 400 MPa.

2. Musi być odpowiedni system stabilizacji białke multimetrycznych.

3. Występują specyficzne białka błonowe – poryny.

RADIOFILE

Mikroorganizmu któ®e są odporne na wyskie poziomy promieniowania jonizującego i świetlnego. Deinococcus radiophilus był to pierwszys mikroorganizm z tej grupy. Jest najbardziej odporny na promieniowanie gamma. Przyżywa dawkę 1,5 mln radów. Jest to poliekstremofil. Jest odporny na niskie i wysopkie temperatury, na srodowekiac kwasne, wysuszenia, wysoka próznie. Jedna z przyczyn jego odporności jest mechanizm bardzo wydajnego molekularnego systemu naprawy DNA. Popularne drożdże Sacharaomyces cerevisiae Hansen wykazuja wyoska przeżywalność w rdzeniu reaktora atomowego.

METALOFILE

Kolonizuja osady i wody przemysłowe, odpady i glebę o wysokim stężeniu metali ciężkich. Przykadem może być Ralstonia metalliduraris. Przeżywa w podłożach o milimolowych stężeniach metali. W swojej komórce zawiera dwa duże plazmidy, które zawieraja geny, opodiwedzialen za odpowirność za stężenia metali ciężkich.

KSEROFILLE

Żyją w bardoz suchych środowiskach: pustynie zimne i gorące, wysuszone skały i w środowiskach wodnych poniżej aktywności wodnej <0,8. Wystepuja tutaj endplity i Hipolity. Zasiedlaja pęknięcia skła i denne czesci skał i kamieni. Do nich zalicza się mikroorganizmu z grupy metanobacterium, cyjanobaterie (mają bardoz wydajne systemy fotosyntezy).

OLIGOFILE

Mikroorganizmu, które rozwijaja się przy bardzo małej zawartości rozpuszczlanej materii organicznej. Gdzie jest bardzo mało źródła węgla. Przykładem może byuć batkeria Sphingomonas sp. Bakteria ta pochodzi z Alaski. Rozmiary tej bakteri zależna nie tylko o rodzaju wzrostu i stężenia źródła węgla. Im mniej zródła węgla, tym bateria mniejsza. Genomy tych oligifili maja minimalne rozmiaru, m.in. że zawieraj tylko pojedyncze kompie poszczególnych genów.

MIKROAREOFILE

Organizmy, które rosna przy stężeniach tlenu niższych niż 21%. Najczęściej są to stężenia z zakresu 2-10%. Nadmiar tlenu je zabija, ponieważ, ze są to organizmu, ktroe posiadaja małokatywner enzymy katalzae i dysputaze ponadtlenkową. Wykorzystuja tlen jako koncowych akceptor w łancuchu oddechowym, czyli tak jak u normalnych organizmach. Przykładem jest Helicobacter peroli.

Kierunki wykorzystania ekstremo fili i enzymów ektremofil nych:

1. Barofile – enzymy proteolityczne, o których myśli się w wykorzysaniyu w przetwórkeiw żywno sic i garbarstwie; hemicelulozy i glukanazy – można je wykorzystać w przmyśle wydobywczym ropy nawtowej.

2. Halofile – enzymy proteolityczne, które mogą być wykorzystane do sytenszy peptydów; hydrolazy i enzymy oksydoredukcyjne – w utylizacji odpadów; hemicelulozy i glukanazy – można je wykorzystać w przmyśle wydobywczym ropy nawtowej; karoten – barwnik w produktach spożywczych; membrany – do produkcji surfaktantów.

3. Acidofile – wykorzystanie enyzymó szlaku utleniani siarki do wykorzystania do odsiarczania węgla.

4. Alkalofile – duży nacisk kładzi się na enzymy proteolityczne, lipolityczne i amylolityczne – wykorzystanie w środkach piorących. Bada się również cyklodekstryny, by wykorzystać do stabilizacji sybstracji lotnych, antybiotyki – przemysł farmaceutyczny.

Jak wpływa temperatura na właściwości enzymów:

Właściwość	Wrażliwość
Struktura I-rz	Minimalna
Struktura II-rzędowa	Niewielka
Struktura III-rzędowa	Wyraźna
Struktura IV-rzędowa	Duża
Interakcje z membranami	Bardzo duża
Stabilność substratu lub produktu	Możliwa
Wiązanie ligandu	Bardzo duża
Funkcja katalityczna	Bardzo duża
Regulacja	Bardzo duża

Wspólne właściwości mezo-, psychro- i temozymów:

1. 40-80% homologi sekwencji aminokwasów,

2. Zbliżona struktura przestrzenna,

3. Identyczny mechanizm katalizy.

TERMOZYMY

Strukturalne właściwości decydujące o ich termosatblilności:

1. Mają większą hydrofobowośc, połączonych z lokalna siecią wiazaβń wodorowych wystpeujacej w Redzeniu cząsteczki. Powoduje to spadek zawartości i objętości wewnętrznych jamnistości molekuł białka i jamnistości są mniejsze. Łańcych peptydowy jest bardziej upakowany, w porównaniu do mezozymu. Stosunek powierchni białka do jego objętości jest mniejszy niż w przypadku enzymów mezofilnych. Nieco większy jest hydrofobowy rdzeń cząsteczki niż u mezozymów. Bardzo często pojawiaja Asię w termozymi dodatkowe miejsca wiązania jonu metali.

2. Wzrost liczby mostków solnych, kóre są trwałe w ciepłych srodowuiskach. Stablizizuja II-rzędową. Wzrost liczby mostków solnych towarzysyz wzrost liczby czasteczk argininy. Wyższy jest stosunek ARG/ARG+LYS niż w białkach mezofilnych. Dlatego jest ten wzrost, ponieważ obecność grupy guanidynowej w argininie gwarantuje wiecej możliwości oddziaływać z innymi resztami, po za tym są one bardziej stabilne. Przez grupe guanidynowa mogą tworzyc się podwóje mostki soalne z arginina i powoduje to wzrost liczby mostków solnych.

3. Stabilizacja α-helis, odbywa się poprzez zwiększeni reszt alaniny. Alanina bardzo często zastepuje serynę bądź lizyny. Powoduje to wieksza stabilność halisy i nastepuje kompensacja ładunków na N- i C- końcu przeciwnie naładowanymi resztami.

4. Wzrost liczby wiązań wodorowych. Szczególnie wstara liczba wiazań: reszta-naładowana; reszta-obojętna.

5. Stabilizacja pętli które łączą odcinki o regularnej strukturze II-rzędowej poprzez przez ich skórcenie lub ich eliminację. Następuje w pętli wzrost zawartości proliny a obniża iśe zawartość asparaginy. Są bardziej sztywne.

6. Następuje obniżenie naprężeń konformacyjnych w białkach które zawierają lewoskrętne odcinki heliakalne, odbywa się to poprzez obniżenie zawartości glicyny. Dlatego ponieważ, glicyna nie zawiera β-węgla. Im mniej jest odzaiływań b-egiel-węgiel karbonylowy jest mniej naprężń.

7. Redukcja entropii stanu rozfałdowanego łańcucha białka poprzez wzrost zawartości proliny i glicyny. Jeżeli mamy obniżoną entropię, to mamy wzrost stabilności białka natywnego.

8. Zwiększenie liczby mostków disulfidowych, jednakże nie enzymach hipertermofili, ponieważ mostki usztywniaja łańcuch do tempareatury 60-70C.

9. Biłaka są bardziej odporne na kowalencyjną destrukcję.może ona być związana z deaminacja asparaginy i glutaminy; z utlenieniem cysteiny czy hydroliza wiązania peptydowego miedzy reszta kwasu asparaginowego a dowolnego aminokwasu w środowkiu kwaśnym. Te 3 przyczyny są główną przyczynami denaturacji białaka, to włąśnie odróznia te białka od białek psychrofilnych i mezogilnych. Odpornośc polega na zmiejszone ilość reszta asparaginy. Notuje się wzrost oddziaływań hydrofobowych.

Te wszystkie cechy strukturalne ona mają jeden cel, taki by ta cząsteczka termozytu był bardziej sztywna, a przez co była bardziej odporna na termo inaktywacje.

Wykład 13

10.1.2011

Kinetyczne właściwości termozymów:

1. Wrodzona tj. wynikająca ze struktury, termostabilnośc, podwyższona czasem przez czynniki środowiska (sole, poliamidy, glikozylację białka). Np. Ferorodoksyna z P. fumaris jest stabilna 24 godziny w 95 stopniach, a aamylopullulanaza z tego organizmu w obecności jonów wapnia zachowuje aktywność do 145 stopni Celsjusza.

2. Przesunięcie krzywej aktywności w frakcji temperatury w stronę wyższych temperatur. Tw powyżej 65 C a dla enzymów z hipertermofili nawet w zakresie 90-115 śewdni.

3. Podwyższenie stałej kinetycznej w wyższych przedziałach temperatury.

Stabilność termiczna koenzymów jest mniejsza.

Wśród hipertermofili przeważaja archeony, które oprócz wyoskiej temperatury wykazuja

Proteiznazy i najwyższej termo stabilności.

Kaldolizyna – pozakomórkowa metaloproteinaza Thermus aquatiqus. T1/2 – 1h w 90 st, w nieobecności Ca szybko ulega denaturyacjia > 100 stC

Akwalizyna – proteinaza serynowa, pozakomórkowa. T.aq. subtilizynnopodobna, zawiera mostki disarczkowe S-S top =90 stC

Archealizyna – pozakomówkoa serynowa proteinaza. Top 98 stC.

Enzymy pochodzące z termofili nie SA to enzymy sekrecyne pozakomó®kowe tylko wewwnatrzkomórkowe lub pozostające związane z komórką.

Jakie znaczenie mają enzymy pochodzące z drobnoustrojów ekstremofilnych?

• Zwiększania rozpuszczalności i biodostępności wielu związków organicznych

• Spadek lepkości i wzrostu współczynnika dyfuzji związków organicznych co owocuje isntonym wzrostem szybkoscie procesuy (skrócenie czasu procesu).

• Zmniejszenie ryzyka zakażem mikroflorą mezofilną.

Gdzie stosuje się te enzymy:

1. Biologia molekularna

   1. Amplifikacja DNA, PCR, i LCR

   2. Sekwencjonowanie genów

2. Przemysł chemiczny

   1. Papiernicjow (bielenie makulatury i pulpy drzewnej – ksylazy, lipazy, celulazy)

   2. Chiralna synteza chemiczna (dehydrogenaza 2-alkoholi)

3. Przemysł spożywczy i paszowy

   1. Przetwórstwo skrobi (amylopullulanaza, α-amylaza, cyklodeksrtyny)

   2. Otrzymywanie syropów fruktozowych (izomeraza glukozowa)

   3. Browarnictweo i piekarstwo (proteazy)

   4. Przetwórstwo odpadów keratynowych (proteazy keratonlitytyczne)

4. Przemysł wydobywniczy ropy i gazu ziemnego

5. Chemia gospodarcza

   1. Produkcja środków piorących (proteazy, amylazy)

6. Diagnostyka medyczna (alkaliczna fosfataza)

7. Inne

   1. Biosery

Ograniczenia wykorzystania enzymów z hipertermofili i termofili

Dla enzymów z hipertermofili bo większość archeonów to orga beztlenowe, a temperatury optymalne są bardzo wysokie. Jest bardzo trudna hodowla tych organizów. Stosuje się ekspresje genów w drobnoustrojach mezofilnych.

Wpływ niskiej temperatury na systemy wodne

• Wzrost lepkości wody (kilkakrotny przy spadku od 20 do 0 stC

• Redukcja szybkości dyfuzji i cząsteczek wodny

• Spadek rozpuszczalności soli, wzrost rozpuszczalności gazów

• Wzrost pH buforów biologicznych (opartych zwykle na węglanach) wraz ze spadkiem temperatury, co wpływa na grakcję białke na skutek zmian ich rozpuszczalności i ładunku reszt aminokwasowych, zwłaszcza histydyny (pK=6,5-7,4)

Jakimi cechami adaptacyjnycjmi cechuja się enzymy niskich temperatur – psychrozymów:

• Objętość cząsteczki są znacznie mniejsze

• Zmnjesza się ilość interakcji hydrofobowych

• Niższa zawartośc proliny

• Niższy udział argininy w puli aminokwasów zasadowych (noższa wartość stosunku Arg/Arg + lys

• Obniżona ilośc mostów solnych (obniżona spójność molekuły)

• Stabilizacja α-helis ( u nielicznych psychorozymów, np. izomerazy trio fosforanowej z natarktycznego szczepu MOraxella Ta137).

• Wyższa zawartość reszt Glicyn y (w niektórych li[Azach antarktycznych bakterii), które są korzystniejsze energetycznie, ponieważ ułatwiają konformacyjne modyfikacje białka podczas katalizy w niskich temperaturach

• Wiksza liczba oddziaływań z rozpuszczalnikami na powierzchni molekuły, spowodowana wzrostem liczby reszt polarnych w tym obszarze.

• Wysoka giętkość stanu sfałdowania bez istotnych zmian w strukturze II-rzędowej, z licznymi zmianami w pętlach łańcucha polipeptydowego w stosunku do mezofili.

Właściwości kinetyczne psychrozymów

• Obniżone o co najmniej 15-20 st C temperatury optymalne w porównaniu z mezofilnymi odpowiednikami i stosunkowo wysoka aktywnośc poniżej 20 stC, a cześto również w ) stC i poniżej ( krzywa aktywno sci w funkcji temperatury przesunieta w steone niższego zakresu).

• W zakresie 0-30 stC reaktynowc enzymu K kat i jego fizjologiacz (stała specyficzność kkat/Km) skuteczność wyższe niż w mezofilnych odpowiednikach.

• Ograniczona stabilność termiczna co przejawia się szybką denaturacją w umiarkowanych temperaturach i co jest kinetyczną konsekwencją gęstości strukturalnej psychrozymów.

Obniżenie temperatury procesu biotechnologicznego prowadzi do:

• Poprawy jakości produktu końcowego, jeśli w wyższej temperaturze może ona ulec niekorzystnej modyfikacji

• Obniżenia kosztów procesu dzięki rezygnacji z drogich systemów grzewczych

• Zmniejszenia ryzyka zakażenia mikroflorą mezofilną

• Zmniejszenia czasu i obniżenia temperatury konieczne do termicznej inaktywacji….

Możliwości aplikacji psychrozymów i ich producentów

1. Ochrona środowiska

   1. Biodegradacja poluantów w zimnym i umiarkowanym klimacie

   2. Reaktywacja zanieczyszczonej gleby In situ

   3. Produkcja biogazu w zimnym i umiarkowanym klimacie

2. Przemysł spożywczy

   1. Serowarstwo

   2. Piwowarstwoe

   3. Konserwacja żywności

   4. Przetwórstwo owoców

   5. Tenderyzacja mięsa

3. Chemia gospodarcza

   1. Produkcja środków piorących

4. Biotransformacje w niskich temperaturach

   1. Modyfikacje antybiotyckjów

   2. Otrzymywanie nienasyconych estrów wosków

   3. Synteza nienasyconych triacylogliceroli

   4. Synteza i modyfikacje niektórych związków

   5. Enzymatyczna synteza estró peptydów itd.

5. Biologia molekularna

6. Inne

   1. Odwłaszanie skór w garbarnictwie

   2. Odzysk srebra z błon rentgenowskich

   3. Produkcja lotnych związków lub ich modyfikacje

   4. Biogeochemia (odzysk metali z rud).