3. Aminokwasy

Wiadomości wstępne

Budowa

Aminokwasy to związki organiczne posiadające co najmniej jedną grupę aminową i karboksylową. Znakomitą większość aminokwasów stanowią α-aminokwasy, w których grupa aminowa dołączona jest do węgla α kwasu karboksylowego (pierw­szy atom węgla licząc od grupy karboksylowej). Węgiel ten jest asymetryczny, w wyniku czego, podobnie jak w przypadku węglowodanów, mogą tworzyć się formy izomeryczne D i L. Jako składniki komórek roślinnych i zwierzęcych dominują jednak aminokwasy w formie L, a w białkach występuje wyłącznie 20 aminokwasów w formie L.

	COOH
	|
H2N-C-H
	|
	R

Ze względu na obecność w aminokwasach przynajmniej jednej grupy kwaso­wej i jednej zasadowej, związki te mają charakter amfoteryczny, co oz­na­cza, że w zależności od pH środowiska ujawniają się ich kwasowe lub alkalicz­ne właściwości. Niskie pH (wysokie stężenie jonów wodoro­wych) zgodnie z prawem działania mas cofa dysocjację grup karboksylo­wych, a wzmaga dy­socjację grup aminowych (przyłączanie protonu), nato­miast w środowisku alkalicznym (wysokie stężenie jonów OH ˉ, niskie stę­żenie jonów wodorowych) zdyso­cjowane są jedynie grupy karboksylowe w wyniku odłączania protonu. Stąd w środowisku kwaśnym cząsteczki amino­kwasów zyskują dodatni ładunek elektryczny, a w śro­dowisku alkalicznym – ładu­nek ujem­ny (Rys. 3.1). War­tość pH, przy której następuje jedna­kowy stopień dysoc­ja­cji obydwu ro­dzajów grup funk­cyjnych amino­kwasu, w wyniku czego cząsteczki tego aminokwasu utrzymywane są w stanie tzw. jonu obo­jna­czego o zerowym su­marycznym ładunku elektrycz­nym, nazywa się punk­tem izoelek­trycznym tego aminokwasu.

Rys. 3.1. Przyjmowanie ładunku elektrycznego aminokwasu w zależności od pH środowiska

Aminokwasy są podstawowym składnikiem białek. Aminokwasy wykazuja różne właściwości determinujące zarówno właściwości białek, jak i ich zróżnicowane funkcje w komórkach. Aminokwasy klasyfikuje się według kilku kryteriów:

1. Według stopnia kwasowości albo inaczej według wartości ich punktu izoelektrycznego:

• na obojętne (posiadające jedną grupę aminową i jedną karboksylo­wą), np. glicyna, alanina, walina, leucyna;

• kwaśne (posiadające jedną grupę aminową i dwie karboksylo­we), do których zaliczamy kwas glutaminowy i kwas asparaginowy;

• zasa­dowe (posiadające więcej niż jedną grupę aminową) np. arginina, lizyna, histydyna; lub posiadające grupę hydroksylową, np. treonina, seryna, tyrozyna.

2. Według stopnia hydrofilności lub hydrofobowości:

• na aminokwasy hydrofobowe, zawierające rodnik węglowy alifatyczny (glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna) lub aromatyczny (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina);

• aminokwasy hydrofilne, zawierające zdolne do dysocjacji dodatkowe grupy kwaśne lub zasadowe, a więc wymienione wcześniej aminokwasy kwaśne i zasadowe.

3. Według obecności, bądź nieobecności siarki:

• na siarkowe (cysteina, cystyna i metionina);

• aminokwasy pozostałe nie zawierające siarki.

4. Według miejsca biosyntezy aminokwasu (dotyczy zwykle organizmów cudzożywnych):

• aminokwasy eg­zogenne, otrzymywane wyłącznie z pokarmem (walina, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, tryptofan, treonina, metionina, lizyna);

• aminokwasy endogenne wytwarzane w komórkach – wszystkie pozostałe.

Charakterystyczna budowa α-aminokwasów umożliwia ujawnienie najważniejszej ich funkcji biologicznej, jaką jest zdolność do łączenia się w długie liniowe makrocząsteczki, nazywane oligo- lub polipeptydami, które, jeśli pełnią funkcję fizjologiczną, noszą nazwę białek.

Amino­kwasy łączą się dzięki obecności grupy karboksylowej –COOH i sąsiadującej z nią grupy aminowej –NH_2. Należy podkreślić, że w powstawaniu łańcuchów polipeptydów lub białek nie uczestniczą żadne inne grupy funkcyjne w aminokwasach, oprócz wymienionych powyżej. Z tego powodu cząsteczka jednego aminokwasu może połączyć się wyłącznie z jedną cząsteczką innego aminokwasu, np. po stronie prawej oraz z jedną cząsteczką po stronie lewej. Dlatego produktem łączenia się aminokwasów mogą być wyłącznie liniowe cząsteczki. Własności cząsteczek polipeptydów i białek zależą od tego w jakiej kolejności i jakie aminokwasy połączyły się w cząsteczkę, co nazywa się sekwencją aminokwasów. Sekwencja aminokwasów danego białka określa jego tzw. pierwszorzędową strukturę. Struktura ta opisywana jest według przyjętej powszechnie umowy, że aminokwasem pierwszym jest ten, który ma wolną grupę aminową (nie ma „sąsiada” z lewej i stanowi tzw. N-ko­niec), a z kolei aminokwas ostatni to ten, który ma wolną grupę karboksylową (nie ma „sąsiada” z prawej strony i stanowi tzw. C-koniec) (Rys. 3.2).

Wynikiem połączenia się grupy karboksylowej jednego aminokwasu i grupy aminowej innego aminokwasu jest wydzielenie się cząsteczki wody i powstanie nowego wiązania łączącego te aminokwasy – tzw. wiązania peptydowego –CO-NH-, w którym –CO- jest pozostałością grupy karboksylowej, a grupa –NH- jest pozostałością grupy aminowej.

Atom wodoru występujący w wiązaniu peptydowym jest słabo związany z atomem azotu i może przemieszczać się w cząsteczce w kierunku atomu tlenu. Obydwa wymienione atomy posiadają wolne pary elektronów, do których atom wodoru pozbawiony swojego elektronu może się przyłączać, stąd też wiązanie peptydowe występuje w dwóch formach molekularnych przechodzących w siebie nawzajem, które nazywamy formami tautomerycznymi:

–CO-NH- ⇔ –C=N-

OH

Jak widać, w jednej z tych form występuje podwójne wiązanie pomiędzy atomami azotu i węgla –(COH) = N–, a więc wiązanie to ma w części charakter wiązania nienasyconego. Wiązanie podwójne jest sztywne i płaskie. Oznacza to, że w łańcuchu polipeptydowym niektóre wiązania są sztywne, a inne mogą swobodnie rotować. Fakt ten decyduje o budowie całych cząsteczek polipeptydów i białek, określając ich strukturę przestrzenną nazywaną strukturą drugorzędową.

Rys. 3.2. Powstawanie wiązania peptydowego pomiędzy dwoma aminokwasami z zaznaczeniem N-końca i C-końca peptydu

Właściwości

Wszystkie aminokwasy mają część cząsteczki taką samą. Wspólna część obejmuje atom węgla α (pierwszy atom węgla licząc od grupy karboksylowej), do którego przyłączona jest grupa aminowa i karboksylowa. Ta część cząsteczek aminokwasów służy do ich łączenia się w procesie powstawania białka. Różnice pomiędzy poszczególnymi aminokwasami dotyczą dalszej części cząsteczki, do której przyłączone są różne grupy funkcyjne. Ta część stanowi „wizytówkę” danego aminokwasu. To właśnie od obecności grup funkcyjnych zależy charakter oraz właściwości każdego z aminokwasów oraz właściwości białka powstającego po połączeniu się aminokwasów w określonej sekwencji.

Funkcje

Główna funkcja i znaczenie aminokwasów wynika z faktu, że budują one wszystkie białka występujące w komórce. Aminokwasy budują też cząsteczki peptydów o sekwencji zapisanej w kodzie genetycznym, jak i tzw. nierybosomalnych o różnorodnej funkcji.

Poza tym można wymienić następujące inne funkcje wolnych aminokwasów:

• z aminokwasów po procesie dezaminacji uwalnia się azot w formie przyswajalnej dla roślin, służący do syntezy innych związków organicznych;

• szkielety węglowe aminokwasów, jak i elementy ich łańcuchów bocznych mogą być substratami do budowy innych aminokwasów oraz wielu innych biologicznie ważnych związków;

• aminokwas prolina oraz niektóre aminokwasy niebiałkowe (np. betaina glicyny) kumulują się w komórkach w stanie stresu wodnego, ponieważ ich cząsteczki stanowią czynnik wiążący zasoby wody komórkowej i przez to chronią struktury komórkowe przed odwodnieniem;

• niektóre aminokwasy niebiałkowe mogą być antybiotykami, neuroprzekaźnikami u zwierząt, czy składnikami koenzymów.

ĆWICZENIA

3.1. Analiza jakościowa aminokwasów

Na podstawie reakcji a, b, c rozróżnić następujące związki: prolinę, metioninę, cysteinę, tyrozynę oraz kwas bursztynowy.

a. Odróżnianie aminokwasów od innych związków

Wykonanie:

Odmierzyć do 5 probówek po 0,5 cm³ roztworów oznaczonych jako A, B, C, D, E. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 cm³ 0,1% roztworu ninhydryny w acetonie i ogrzewać przez trzy minuty na łaźni wodnej. Pojawia się intensywne zabarwienie fioletowe w obecności wolnego aminokwasu lub żółte w obecności wolnego aminokwasu (Rys.3.3). Reakcja ta może być używana do ilościowego oznaczania wolnych aminokwasów, a reakcja z tzw. kwaśną ninhydryną (roztwór ninhydryny w mieszaninie kwasu octowego i fosforowego) do ilościowego oznaczania wolnej proliny.

Rys. 3.3. Wzory strukturalne A. izoleucyny i B. proliny (iminokwasu)

A B

b. Wykrywanie wolnych grup tiolowych

Zasada:

Do aminokwasów zawierających atomy siarki należy metionina, cysteina i cystyna (Rys. 3.4). W celu wykrycia obecności grupy tiolowej należy do eksperymentu wziąć cysteinę lub cystynę, bowiem metionina ma atom siarki związany z grupą metylową.

Rys. 3.4. Wzory strukturalne A. metioniny, B. cysteiny i C. cystyny.

A B C

Wykonanie:

Odmierzyć do probówek po 0,5 cm³ roztworów niezidentyfikowanych w punkcie a. aminokwasów (tj. wszystkie z wyjątkiem zidentyfikowanej proliny). Do każdej próbki dodać po 1 cm³ 20% roztworu NaOH oraz po 0,25 cm³ 2% roztworu octanu ołowiowego. Ogrzewać przez 3 do 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. W obecności grup tiolowych tworzy się brunatnoczarny osad.

c. Wykrywanie obecności pierścieni aromatycznych

Zasada:

Do aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny zaliczane są: tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina (Rys. 3.5). Ten ostatni aminokwas jest na tyle niestabilny, że w poniżej przedstawionej reakcji w roztworze wodnym pierścień aromatyczny ulega rozerwaniu. Obecność grup –OH przy pierścieniu zwiększa natomiast jego trwałość. Z tego względu eksperyment lepiej wykonać na tyrozynie i tryptofanie.

Rys. 3.5. Wzory strukturalne aminokwasów aromatycznych

Wykonanie:

Odmierzyć do probówek po 0,5 cm³ roztworów niewyeliminowanych w podpunktach a i b. Do każdej próby dodać po 0,5 cm³ stężonego kwasu azotowego i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po ostudzeniu dodać ostrożnie (!), małymi porcjami, i ciągle mieszając po 1,75 cm³ 20% roztworu NaOH. W obecności pierścieni aromatycznych pojawia się pomarańczowe zabarwienie.

Sprawozdanie:

Podać jakie związki były oznaczone literami A, B, C, D, E i na jakiej podstawie poszczególne aminokwasy zostały rozróżnione.

3.2. Oznaczanie ilościowe aminokwasów metodą formaldehydową Sorensena

Zasada:

Formaldehyd (HCOH) kondensuje z grupą aminową aminokwasów wy­dzielając wodę i two­rząc grupę –N=CH₂. Tym samym aminokwasy tracą wła­ściwości am­fo­terycz­ne i można je miareczkować wodorotlenkiem sodowym w obecności fenolo­ftaleiny.

COOH COOH

| |

H-C-NH₂ + HCOH = H-C-N=CH₂ + H₂O

| |

R R

Wykonanie:

Pobrać 10 cm³ roztworu glicyny do kolby stożkowej, dodać 20 cm³ 20% formaliny (pod wycią­giem) i zmiareczkować 0,1 M roztworem NaOH wobec fenoloftale­iny. Od­dzielnie w ten sam sposób wykonać miareczkowanie ślepej próby (do formaliny dodać wodę destylowana zamiast roztworu aminokwasu zachowując proporcje objętościowe oraz dwie krople fenoloftaleiny). Z różnicy ilo­ści zużytego NaOH wyliczyć ilość moli aminokwasu w próbce. Wynik podać w mg/cm³. Biorąc pod uwagę, że 1 mol NaOH reaguje z 1 molem aminokwasu można wyliczyć, że 1 cm³ 0,1 M roztworu NaOH odpowiada 100 mikromolom aminokwasu.

3.3. Miareczkowanie aminokwasu

Wykonanie:

Do zleweki o pojemności 50 cm³ nalać po 20 cm³ 1 M roztworów trzech różnych aminokwasów, np. alaniny, kwasu glutaminowego i lizyny. Zlewkę ustawić na mieszadle magnetycznym, wrzucić do środka „element mieszający”, uruchomić mieszadło i umieścić w zlewce elektrodę pH-metru w sposób uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH. Dodawać stopniowo (po 0,5 cm³) 10 cm³ 0,01 M roztworu HCl. Każdorazowo, po ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość. Powtórzyć procedurę używając do miareczkowania roztworu NaOH o stężeniu 0,01 M.

Sprawozdanie:

Na podstawie obydwu wyników narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na osi y ilość dodanego HCl (wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu wartość punktu izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pK_a i pK_b (punkty przegięcia krzywej). Narysować na wykresie w jakich formach jonowych występuje dany aminokwas na poszczególnych odcinkach krzywej, oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg. Przykładową krzywą miareczkowania glicyny przedstawiono na Rys. 3.6.

Rys. 3.6. Przykładowa krzywa miareczkowania glicyny

3.4. Chromatografia bibułowa aminokwasów

Zasada:

Informacje na temat metod chromatograficznych podano na str…..

Wykonanie:

Przygotować cztery szalki Petri’ego. Do dolnej części każdej z szalek wlać rozpuszczalnik (mieszaninę trzeciorzędowego butanolu, 88% kwasu mrówkowego i wody w stosunku objętościowym 15:15:70). Z bibuły wyciąć 4 krążki o średnicy trochę większej niż szalka. W każdym krążku naciąć pasek o szerokości 5 mm dochodzący do środka krążka i zagiąć tak, by tylko on sięgał do rozpuszczalnika w szalce, a reszta krążka była w powietrzu. W odległości od środka krążka zakreślić ołówkiem na naciętym pasku kółeczko o średnicy (Rys. 3.7 b). Na narysowaną kroplę nakładać powoli 1% roztwory: glicyny, fenyloalaniny, seryny i badanego aminokwasu (na jeden krążek po jednym aminokwasie). Nanoszenie przeprowadzamy stopniowo (tak by mokra plama nie wyszła poza zaznaczone pole) za pomocą pipety o pojemności 0,2 do 10 µl. Po dodaniu każdej kolejnej kropli bibułę należy przesuszyć. Łącznie należy nanieść 20 µl aminokwasu.

Rys. 3.7. Schemat chromatografii bibułowej aminokwasu

a) widok ogólny b) nakładanie aminokwasu c) sposób odczytu R_f

Krążek bibuły umieścić między dwiema częściami szalki tak, by koniec zgiętego paska zanurzył się w rozpuszczalniku, a brzegi wystawały poza szalkę (Rys. 3.7 a). Tym paskiem rozpuszczalnik będzie podsiąkał i stopniowo rozprowadzał aminokwas ku brzegom krążka. Po około godzinie, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do brzegu bibuły, wyjąć chromatogram i zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika. Całość wysuszyć w 110°C i spryskać 0,1% roztworem ninhydryny w 95% etanolu i wysuszyć ponownie w 110°C. Barwny krążek obrysować ołówkiem. Obliczyć współczynnik migracji R_f dla każdego wzorcowego i badanego aminokwasu według wzo­ru: (Rys. 3.7 c). Zidentyfikować nieznany aminokwas porównując wartości R_f nieznanego aminokwasu z R_f wzorców.

3.5. Oznaczanie zawartości proliny

Zasada:

Prolina jest aminokwasem syntetyzowanym często w reakcji obronnej rośliny na stresy powodujące odwodnienie cytoplazmy, przykładowo w czasie suszy czy w trakcie wzrostu rośliny w zasolonym podłożu. Główną rolą proliny jest obniżenie potencjału osmotycznego komórki dla wyrównania stężeń jonów pomiędzy wakuolą, gdzie są akumulowane sole, a cytoplazmą. Ponadto, prolina chroni strukturę białek i błon cytoplazmatycznych przed ujemnymi skutkami zbyt dużego stężenia jonów soli.

Wykonanie:

Ilościową analizę zawartości wolnej proliny wykonuje się najczęściej metodą kolorymetryczną (Bates i in. 1973). Tkankę roślinną o masie 250 mg homogenizować w 3% kwasie sulfosalicylowym, a następnie odwirować przy 16 000 x g. Do 2 cm³ supernatantu dodać 2 cm³ lodowatego kwasu octowego i 2 cm³ kwaśnej ninhydryny (1,25 g ninhydryny rozpuścić w 30 cm³ lodowatego kwasu octowego i 20 cm³ 6 M kwasu ortofosforowego). Całość zmieszać na wstrząsarce, a następnie inkubować przez 1 godzinę w 100ºC. Po zatrzymaniu reakcji w lodzie do próbek dodać 4 cm³ toluenu i ponownie wytrząsać. Toluen zawierający barwnik odessać znad fazy wodnej i po osiągnięciu temperatury pokojowej zmierzyć jego absorbancję przy λ=520 nm względem ślepej próby, którą stanowił toluen. Stężenie aminokwasu obliczyć na podstawie równania regresji liniowej dopasowanego do punktów krzywej kalibracyjnej wykonanej dla roztworów proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym o stężeniu: 3,62; 7,25; 12,5; 25 i 100 μg/cm³.

Piśmiennictwo:

Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D., 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and Soil 39: 205-207.