III zajęcia:
1. funkcje dopełniacza i składniki, które za nią odpowiadają
1) Obrona przeciwzakaźna:
a) opsonizacja( zjawisko ułatwiania fagocytozy)- C3b i C4b
b) chemotaksja( aktywacja fagocytów, degranulacja komórek tucznych i bazofilów, zwiększenie przepływu krwi)- C3a, C4a, C5a
c) liza komórek bakteryjnych i zakażonych- kompleks MAC( kompleks atakujący błonę, złożony z C5b-9)
2) Współpraca odpowiedzi nieswoistej ze swoistą:
a) wzmaganie odpowiedzi humoralnej- fragmenty C3b i C4b połączone z kompleksem antygen-przeciwciało, związane przez receptory CR2 na limfocytach B
b) rozwój pamięci immunologicznej- fragmenty C3b i C4b w połączeniu z CR2 i CR3 na komórkach dendrytycznych
3) usuwanie zbędnych produktów:
a) kompleksów immunologicznych i komórek apoptotycznych- C1q, C3, C4
2. lizozym - na jakie bakterie działa, metoda oznaczania
Lizozym( in. muraminidaza) działa na wszystkie bakterie Gram-dodatnie z wyjątkiem Gronkowca złocistego( Staphylococcus aureus). Lizozym należy do białek kationowych. Obecny jest w ziarnistościach komórek żernych, a także w osoczu krwi, łzach, ślinie oraz wydzielinach śluzowo-surowiczych dróg oddechowych. Jego biochemiczne działanie polega na hydrolizie wiązania beta 1,4-glikozydowego między kwasem N-acetylomuraminowym i N-acetyloglukozaminą, które stabilizuje ścianę komórek bakteryjnych.
Metoda oznaczania: oznaczanie w surowicy poziomu lizozymu metodą płytkową. Do roztworu agarozy przenosimy zawiesinę Micrococcus lysodeicticus. Agarozę z zawiesiną należy rozlać miarowo do jałowych płytek Petriego. Po zastygnięciu przenosimy płytki z podłożem do lodówki na 30 min. W zestalonym żelu wycinamy otworki o średnicy 4mm oddalone od siebie o co najmniej 4cm. Wlewamy do wyciętych dołków po 50µl roztworów wzorcowych( I, II, III) o znanym stężeniu lizozym( rozcieńczenia lizozymu jaja kurzego) i do kolejnych dołków po 50µl surowic badanych. Inkubujemy test 24h w komorach wilgotnych w T 37st. C. Po inkubacji odczytujemy strefy przejaśnienia wokół dołków i z krzywej standardowej odczytujemy stężenie lizozymu w badanej próbce.
3. odczyn wiązania dopełniacza - zasada metody
Nie służy do oznaczania składników dopełniacza. Metoda ta służy do wykrywania kompleksów immunologicznych w badanej surowicy( z reguły wykrywamy przeciwciało). Polega na konkurencji dwóch układów: wskaźnikowego oraz badanego o dopełniacz. Układ wskaźnikowy stanowią erytrocyty baranie opłaszczone swoistym przeciwciałem, tzw. amboceptorem- jest to surowica królika immunizowanego erytrocytami barana. Układ badany to poszukiwane przez nas przeciwciało i swoisty wobec niego antygen lub odwrotnie. Odczyn jest dodatni w przypadku braku hemolizy, co świadczy o obecności poszukiwanego przeciwciała lub antygenu. Odczyn jest ujemny w przypadku hemolizy- wówczas poszukiwany antygen lub przeciwciało jest nieobecne. Badanie przeprowadzamy w kilku etapach: do inaktywowanego materiału badanego dodajemy antygenów wzorcowych lub przeciwciał wzorcowych. Następnie dodajemy wymiareczkowaną ilość dopełniacza, odpowiednią do ilości użytego antygenu lub przeciwciała w I etapie. Na koniec dajemy erytrocyty opłaszczone amboceptorem. Przykłady: odczyn Wassermana- metoda jakościowa wykrywania kiły, metoda historyczna; odczyn Kolmera- metoda ilościowa w wykrywaniu kiły, metoda historyczna.
1. Składniki odpowiedzi nieswoistej humoralnej – wymienić, opisać funkcję.
a) lizozym- ( in. muraminidaza) działa na wszystkie bakterie Gram-dodatnie z wyjątkiem Gronkowca złocistego( Staphylococcus aureus). Lizozym należy do białek kationowych. Obecny jest w ziarnistościach komórek żernych, a także w osoczu krwi, łzach, ślinie oraz wydzielinach śluzowo-surowiczych dróg oddechowych. Jego biochemiczne działanie polega na hydrolizie wiązania beta 1,4-glikozydowego między kwasem N-acetylomuraminowym i N-acetyloglukozaminą, które stabilizuje ścianę komórek bakteryjnych
b) układ dopełniacza- obrona przeciwzakaźna: opsonizacja, chemotaksja, liza komórek bakteryjnych i zakażonych; współpraca odpowiedzi nieswoistej ze swoistą: wzmaganie odpowiedzi humoralnej, rozwój pamięci immunologicznej; usuwanie zbędnych produktów, tzn. kompleksów immunologicznych i komórek apoptotycznych
c) białka ostrej fazy- wzmaganie aktywacji dopełniacza, opsonizacja( CRP, MBP), wzmaganie zabijania drobnoustrojów, hamowanie wzrostu bakterii przez białka wiążące jony metali( transferyna, laktoferyna, ceruloplazmina, haptoglobina), ograniczanie uszkodzenia tkanek, np. fibrynogen wspomaga krzepnięcie krwi, inhibitory proteaz neutralizują enzymy lizosomalne uwalniane w czasie fagocytozy
d) cytokiny( hormony układu odpornościowego)- białka wpływające na wzrost, proliferację i pobudzenie komórek biorących udział w odpowiedzi odpornościowej oraz komórek hemopoetycznych. Cytokiny mogą wybiórczo pobudzać odpowiedź komórkową lub humoralną, co w połączeniu z ich ilością (ponad 100 opisanych cytokin i wciąż odkrywane nowe) powoduje, że powstaje niezwykle skuteczny, ale także bardzo skomplikowany i czuły system powiązań pomiędzy komórkami układu odpornościowego, tzw. sieć cytokin
2. Funkcje poszczególnych składowych dopełniacza
1. funkcje dopełniacza
2. lizozym - gdzie co jak i jak oznaczamy ilościowo
3. drogi aktywacji dopełniacza i ich aktywatory.
a) droga klasyczna- kompleksy immunologiczne po zadziałaniu na antygen immunoglobulin: IgG( z wyjątkiem IgG4) i IgM
b) droga alternatywna- bakterie G+ i G-, polisacharydy ścian bakterii, wirusy, grzyby, niektóre komórki nowotworowe, kompleksy immunologiczne zawierające IgG, IgA(?), IgE(?)
c) droga lektynowa- mannoza i fruktoza umieszczone na błonie komórkowej wykrywane przez MBP
4. (bonus na lepszą ocenę) interleukiny prozapalne
IL-1( pobudza wydzielanie IL-6), IL-6
1 Składniki nieswoistej odporności humoralnej
2 Funkcje dopełniacza
3 Wymień drogi aktywacji dopełniacza i jak są uruchamiane
1.Drogi dopełniacza - jakie, czym aktywowane, jakie podobieństwa i różnice
a) droga klasyczna- kompleksy immunologiczne po zadziałaniu na antygen immunoglobulin: IgG( z wyjątkiem IgG4) i IgM
b) droga alternatywna- bakterie G+ i G-, polisacharydy ścian bakterii, wirusy, grzyby, niektóre komórki nowotworowe, kompleksy immunologiczne zawierające IgG, IgA(?), IgE(?)
c) droga lektynowa- mannoza i fruktoza umieszczone na błonie komórkowej wykrywane przez MBP
Podobieństwa: kończą się utworzeniem kompleksu MAC, w każdej zostaje utworzona konwertaza C3 i C5.
Różnice: drogi dopełniacza różnią się początkiem, aktywatorami.
2.Składniki odporności humoralnej nieswoistej i ich funkcje
3.Rola biologiczna układu dopełniacza
IV zajęcia:
1. Wymienić profesjonalne komórki fagocytarne i opisać ich funkcję przeciwzakaźną
1 Makrofagi, granulocyty - występowanie, funkcje, mechanizm działania bójczego
Makrofagi:
-występowanie: tkanki
-funkcje: fagocytoza i zabijanie wewnątrzkomórkowe, np. listerii, salmonelli, prątków( jeśli prątki nie zostaną do końca zniszczone mogą bytować w makrofagu wiele miesięcy)
- mechanizm działanie bójczego:
Granulocyty obojętnochłonne:
-występowanie: naczynia krwionośne( pula zapasowa i bieżąca), po opuszczeniu krwi żyją w tkankach 1-2 dni.
-funkcje: fagocytoza; zabijanie zewnątrzkomórkowe, np. paciorkowców, gronkowców; zapalenie( degranulacja)
- mechanizm działanie bójczego:
2 Test NBT - zasada, wykonanie, zastosowanie
Zasada: komórki poddaje się działaniu żółtego barwnika, błękitu tetrazoliowego( NBT). Niestymulowane neutrofile nie pochłaniają tego barwnika, podczas gdy komórki stymulowane do aktywności fagocytarnej wchłaniają go do fagosomów. Dochodzi do wewnątrzkomórkowej redukcji, prowadzącej do powstania nierozpuszczalnej krystalicznej postaci barwnika o fioletowym zabarwieniu( kryształy formazonowe).
Wykonanie: do probówki dodajemy 0,1 ml pełnej, heparynizowanej krwi i 0,1 ml odczynnika NBT. Mieszamy i inkubujemy. Przenosimy 3 krople na brzeg szkiełka podstawowego i wykonujemy rozmaz drugim szkiełkiem. Po wyschnięciu preparatu na wolnym powietrzu barwimy hematoksyliną, spłukujemy wodą i po wyschnięciu oglądamy pod mikroskopem( pow. 100x).
Zastosowanie: test NBT informuje o stanie funkcjonalnym neutrofilów, gdyż użyty do testu barwnik może wniknąć do wnętrza komórki jedynie drogą fagocytozy. Daje również informację o aktywności metabolicznej, ponieważ wewnątrzkomórkowa redukcja barwnika zależy od aktywności przemian monofosforanu heksozy, niezbędnych do bakteriobójczego działanie komórki. Zastosowanie w przewlekłej chorobie ziarniniakowatej.
3 Komórki NK - funkcje, mechanizmy cytotoksyczności
Występowanie: różne tkanki organizmu, najwięcej w krwioobiegu- 5-15% ogólnej liczby limfocytów.
Funkcje: zabijanie własnych komórek zakażonych wirusem oraz niektórych komórek nowotworowych.
Mechanizm cytotoksyczności:
2. makrofagi i granulocyty- co, jak i gdzie
3. komorki NK- jakie mechanizmy
1. test NBT
2. neutrofile, makrofagi- opisać, rola itd
3. ADCC opisać
Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał- ADCC. Niektóre komórki wykazują zdolności cytotoksyczne dzięki obecnym receptorom dla fragmentów Fc przeciwciał- są to receptory FcR. Są one zdolne do niszczenia komórek docelowych opłaszczonych przeciwciałami. Aktywność cytotoksyczną wykazują: limfocyty NK, monocyty, makrofagi neutrofile, eozynofile oraz trombocyty. W reakcjach ADCC uczestniczą IgG( przede wszystkim IgG1 i IgG3) oraz IgE. IgE uczestniczy w odpowiedzi przeciw pasożytom z udziałem komórek takich jak: eozynofile, trombocyty i makrofagi.
1. profesjonalne fagocyty: występowanie, działanie, charakterystyka
2. NK:
3. limf. B1: funkcja
- stanowią 20% limfocytów krwi obwodowej i śledziony, 40-60% krwi pępowinowej( dominują w okresie płodowym)
- wytwarzają głównie przeciwciała IgD, IgM
- biorą udzia w odpowiedzi pierwotnej- pierwsza linia obrony, nie różnicują się w komórki pamięci immunologicznej
- uwalniają czynniki regulujące różnicowanie lmfocytów B
- lokalizują się w obrębie błon śluzowych
- charakteryzują się odpowiedzią na antygeny grasiczoniezależne