CYTOGENETYKA CZ. I

Cytogenetyka – dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów

Kariotyp – zespół chromosomów występujący w komórkach somatycznych, typowy dla

danego organizmu, o charakterystycznej liczbie i morfologii

Kariogram – zestaw chromosomów przedstawiony w formie graficznej wg ściśle określonych

zasad

POZIOMY KONDENSACJI CHROMATYNY

• Nić DNA

• Białka histonowe

• Włókno nukleosomalne

• Solenoid

• Pętle solenoidu / domeny

• Rozety

• Chromosom metafazowy

Kondensacja chromatyny służy do utrzymania porządku w komórce

ELEMENTY BUDOWY CHROMOSOMU W METAFAZIE

• Ramiona – górne i dolne

  • Górne = krótkie (p)

  • Dolne = długie (q)

• Telomery – zbudowane z sekwencji niekodujących, chronią geny wewnętrzne oraz
  chromosomy przed zlewaniem się

• Satelity – umieszczone na nitkach satelitonośnych, w których znajdują się geny
  kodujące rRNA. Są zbudowane z heterochromatyny

• Centromer – przewężenie pierwotne chromosomu

• Chromatydy siostrzane

Centromer nie jest fizycznym połączeniem DNA

Długość telomerów wyznacza wiek komórki i ilość podziałów, jakim uległa.

Telomeraza – replikuje DNA od 1. do ostatniego nukleotydu
jest aktywna w komórkach nowotworowych

TYPY BUDOWY CHROMOSOMÓW METAFAZALNYCH

WARUNEK UZYSKANIA CHROMOSOMÓW

Komórka musi posiadać jądro. Bardzo dobry materiał to komórki szpiku kostnego, komórki kosmówki i płynu owodniowego (badania prenatalne), materiał z biopsji cienkoigłowej, limfocyty krwioobwodowe.

HODOWLA CHROMOSOMÓW

• Makrohodowla

• Mikrohodowla

Pobiera się 10 ml krwi z żyły łokciowej. W komórkach znajduje się antykoagulant – heparyna. Zmieszaną krew zostawia się do sedymentacji.

Hodowla musi być prowadzona w warunkach jałowych.

• Płyn hodowlany (podłoże hodowlane)
  substancje odżywcze ; solne mineralne

• Antybiotyki (penicylina, streptomycyna

• Wyciąg z fasoli – fitohemaglutynina – daje możliwość podziału

• T = 37°C

Hodowla trwa 48h. 2h przed zakończeniem hodowli dodajemy kolchicynę (zatrzymuje podział w stadium metafazy)

WYKOŃCZENIE HODOWLI

• Szok hipotoniczny – 0,075 mol/dm3 KCl
  Komórka pęcznieje aż do pęknięcia błony komórkowej

• Odbiałczanie / utrwalanie
  Dodaje się płyn Carnoy’a (metanol + kwas octowy w stosunku 3:1)
  Etap ten wykonuje się 3 razy

• Po dodaniu płynu przenosimy na szkiełko podstawowe aż do wyschnięcia

Dodajemy fioletowy barwnik Gienzy. Jego dodanie umożliwi wstępną analizę

1. Wielkość chromosomów

2. Położenie centromeru

3. Wzór prążkowy (wzór ten jest unikalny)

PODZIAŁ CHROMATYNY

• Euchromatyna

  • Aktywna transkrypcyjnie

  • Dominują pary zasad G-C

• Heterochromatyna

  • Nieaktywna transkrypcyjnie

  • Posiada niewiele genów, które mogą ulec ekspresji

  • Dominują pary zasad A-T

  • Zawiera aminokwasy z mostkami disiarczkowymi

Heterochromatynę możemy podzielić na

• Fakultatywną – może zajść ekspresja, ale nie musi

• Konstytutywną – nie zachodzi ekspresja

TECHNIKI BARWIENIA CHROMOSOMÓW

1. BARWIENIE NA PRĄŻKI G
   Chromosomy poddaje się działaniu trypsyny
   Barwimy barwnikiem Giemzy
   Uzyskujemy wzór prążkowy – prążki jasne i ciemne (300-400 prążków)
   Ciemne – odpowiadają heterochromatynie
   Jasne – odpowiadają euchromatynie
   
   Służy do układania i analizy kariogramu

2. BARWIENIE NA PRĄŻKI Q
   Chromosomy poddajemy działaniu barwnika fluoroscencyjnego (oranż akrydynowy, iperyt akrychinowy)
   Heterochromatyna wiąże więcej barwników niż euchromatyna
   Q+ - mocne światło (heterochromatyna)
   Q- - słabe światło (euchromatyna)
   Jest to uzupełniające barwienie do tego na prążki G

3. BARWIENIE NA PRĄŻKI C
   Usuwamy trochę DNA za pomocą Ba(OH)₂ lub DNazy
   Barwimy barwnikiem Giemzy
   Ta technika służy do analizy heterochromatyny konstytutywnej centromerowej i przycentromerowej
   Robi się to dla wykrycia polimorfizmu ; polega na zmiennej zawartości heterochromatyny konstytutywnej w centromerach i okolicach przycentromerowych chromosomów A1, C9, E16
   Analiza tych polimorfizmów jest wykorzystywana w medycynie sądowej

4. BARWIENIE NA PRĄŻKI R
   Odwrotne niż na prążki G
   Stosujemy bufor fosforanowy w wysokiej temperaturze
   Dodajemy barwnik Giemzy
   Prążki jasne – heterochromatyna
   Prążki ciemne – euchromatyna
   Wykorzystuje się do analizy uszkodzeń w obrębie telomerów

5. WYSREBRZANIE ORGANIZATORÓW JĄDERKOTWÓRCZYCH (AgNOR)
   Stosujemy AgNO₃
   Barwią się satelity i nitki, których wielkość jest zmienna

ABERRACJE LICZBOWE I STRUKTURALNE CHROMOSOMÓW

Kariotyp człowieka – 46 chromosomów (44 autosomy + 2 chromosomy płci)

KRYTERIA UKŁADANIA KARIOGRAMU

1. Wielkość chromosomu

2. Położenie centromeru

3. Rozmieszczenie prążków w chromosomie

ABERRACJE CHROMOSOMOWE LICZBOWE

• Poliploidia – liczba chromosomów stanowi wielokrotność liczby haploidalnej

  • Triploidia 3n 69 XXY

  • Tetraploidia 4n 92 XXYY

• Aneuploidia – liczba chromosomów nie stanowi wielokrotności liczby haploidalnej

  • Monosomia

  • Trisomia

Przyczyną aneuploidi jest nondysjunkcja (nieprawidłowe rozejście się chromosomów)

Aberracje zrównoważone – w czasie ich powstawania nie dochodzi do utraty lub zwiększenia
ilości materiału chromosomowego – nie mają wpływu na cechy
fenotypowe nosiciela

Aberracje niezrównoważone – podczas ich powstawania następuje zmniejszenie lub
zwiększenie, w stosunku do stanu prawidłowego, ilości
materiału chromosomowego

ABERRACJE STRUKTURALNE

• DELECJA (del)

46, XX, del(5)(q13)
Delecja terminalna ramion długich chromosomu pary 5 od prążka q13

• DELECJA INTERSTYCJALNA

46, XX, del(5)(q13q33)
Delecja interstycjalna wewnętrznego fragmentu ramion

• DUPLIKACJA (dup)

46, XX, dup(1)(q22q25)
Duplikacja fragmentu chromosomu pary 1 między prążkami q22 i q25

• INWERSJA (inv)

46, XX, inv(3)(q21q26)
Inwersja fragmentu chromosomu między prążkami q21 i q26 w długim ramieniu
chromosomu pary 3

Inwersja paracentryczna nie obejmuje centromeru (te same litery)

Inwersja pericentryczna obejmuje centromer

• INSERCJA (ins)
  Mutacja polegająca na wycięciu fragmentu chromosomu i przeniesieniu go w inne miejsce.
  46, XY, ins(2)(p13q21q31)
  Insercja fragmentu ramion długich chromosomu pary 2 zawartego między prążkami q21 i q31 w ramię krótkie tego chromosomu w prążek 13

• TRANSLOKACJE

  • WZAJEMNA ZRÓWNOWAŻONA (t)
    Przemieszczenie fragmentu chromosomu do innego chromosomu
    46, XY, t(8;12)(q11;q15)
    Translokacja wzajemna zrównoważona między chromosomami pary 8 i 12

  • WZAJEMNA NIEZRÓWNOWAŻONA
    Nieprawidłowy chromosom der(8) pochodzi z chromosomu 8, który powstał
    w wyniku translokacji wzajemnej pomiędzy chromosomami 8 i 12 i zastąpił jeden z chromosomów 8
    46, XY, der(8)t(8;12)(q11;q15)

  • TRANSLOKACJE ROBERTSONOWSKIE (der)
    Translokacja zrównoważona robertsonowska między chromosomami 14 i 21
    45, XX, der(14;21)(q10;q10)
    
    Translokacja niezrównoważona robertsonowska między chromosomami 14 i 21
    46, XX, der(14;21)(q10;q10), +21

• IZOCHROMOSOMY (i)
  Izochromosom ramion długich chromosomu X
  46, X, i(X)(q10)

• CHROMOSOMY DICENTRYCZNE (dic)
  Chromosom dicentryczny złożony z dużych fragmentów (zawiera centromery) chromosomów 13 ; 15
  45, XX, dic(13;15)(q22,q24)

• CHROMOSOMY PIERŚCIENIOWE (r)
  Chromosomy pierścieniowe powstały w wyniku pęknięcia i ponownego zlepienia
  w obrębie prążków p22 i q36 chromosomu pary 7
  46, XX, r(7)(p22q36)

• CHROMOSOMY MARKEROWE (mar)
  Dodatkowy chromosom, nieprawidłowy strukturalnie, o nieznanym pochodzeniu
  47, XX, +mar

MOZAIKA CHROMOSOMOWA

W opisie mozaiki chromosomowej poszczególne linie komórkowe są wymieniane

w kolejności uwzględniającej liczbę chromosomów
46, XX / 47, XX, +21
45, X / 46, X, i(Xq)