•Ligazy

Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami

3’ OH i 5’ PO4

w kwasach nukleinowych – DNA lub RNA.

W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD+ lub

ATP w zależności od typu ligazy.

Funkcja in vivo: udział w replikacji opóźnionego pasma DNA,

rekombinacja genetyczna, naprawa DNA

Zastosowanie ligazy w inżynierii

genetycznej:

Rekombinacja DNA in vitro – łączenie

cząsteczek kwasów nukleinowych

lepkich lub tępych końców oraz szereg

innych bardzo specyficznych

zastosowań.

•Fosfataza alkaliczna

Usuwa 5’-fosforan z ssDNA, dsDNA i RNA, rNTP i dNTP . Metaloenzym (Zn II)

Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna na

ogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcję

defosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris pH 8.0-9.0 w

obecności niskich stężeń Zn+2 (poniżej 1 mM).

Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP –calf intestinal alkaline phosphatase) –

mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C – 30

min lub 75 C – 10 min) w obecności 10 mM EDTA.

Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP – shrimp alkaline

phosphatase) – aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C –15 min

Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej:

•defosforylacja tj. usuwanie 5’ fosforanów z wektorów trawionych

enzymami restrykcyjnymi

•jeżeli DNA wektora zostało strawione jednym enzymem restrykcyjnym

defosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bez

wstawki

•traktowanie DNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowaniaalecane 70 C – 20 min).

•Polimeraza I – polimeraza Kornberga

1. Aktywność: 5’ 3’ polimeryzacja DNA

Substrat: jednoniciowe DNA i starter z wolną grupą 3’OH.

Wymagania: Mg+2, dATP , dTTP , dGTP , dCTP

2. Aktywność: 3’ 5’ egzonukleolityczna-sprawdzająca

Substrat: dsDNA lub ssDNA z wolnym 3’OH końcem. Degraduje DNA od 3’OH.

Ta aktywność na dsDNA jest blokowana przez aktywność polimeryzacyjną 5’—3’.

Wymagania: Mg+2

3. Aktywność: 5’ 3’ egzonukleolityczna

Substrat: dsDNA lub RNA-DNA hybrydy. Degraduje dsDNA od 5’ końca;

degraduje RNA w hybrydzie z DNA - aktywność RNAzy H

Wymagania: Mg+2

Zasosowanie polimerazy I (holoenzymu)

0. Znakowanie DNA przez przesunięcie przerwy (nick-translation).

Tylko ta polimeraza może przeprowadzać tę reakcję ze względu na

aktywność egzonukleazy 5’— 3’

•Fragment Klenowa DNA polimerazy I

polimeraza I pozbawiona N-końcowej domeny stanowi tzw. fragment Klenowa.

Zastosowanie polimerazy Klenowa:

0. Synteza dsDNA na matrycy ssDNA:

Warunki reakcji: matryca ssDNA, startery - oligonukleotydy 6-20 n

komplementarne do określonego fragmentu DNA z wolną grupą OH,

bufor, dNTPs,

Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli

do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub

znakowanych innymi markerami.

0. Wypełnianie cofniętych 3’- końców we fragmentach DNA (fill-in reaction):

Stosuje się w celu tworzenia „tępych końców” we fragmentach powstałych po

trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 5’-wystające końce. 3’

Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli

do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub

znakowanych innymi markerami.

0. Wytrawianie wystających 3’ – końców:

Stosuje się również w celu tworzenia „tępych końców” we fragmentach

powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 3’-wystające

końce.

Aktywność egzonukleazowa 3’→ 5’ polimerazy Klenowa wytrawia wystające

nadmierności.

Tę reakcję można także przeprowadzać z użyciem T4 DNA polimerazy, która ma

znacznie mocniejszą aktywność egzonukleazową (~200 x większą niż Klenow).

•DNA polimeraza bakteriofaga T7

zawiera dwie podjednostki, o aktywnościach takich samych jak

polimeraza Klenowa.

Szczególnie użyteczna ponieważ charakteryzuje się znacznie większą

procesywnością i wysoką wiernością (~1000 x większą niż polimeraza

Klenowa).

Używana jest do sekwencjonowania DNA metodą Sangera, także pod nazwą

Sequenase lub Sequenase 2.0 (bez aktywności 3’→ 5’ egzonukleolitycznej)

•Termostabilne DNA polimerazy

DNA-zależna polimeraza DNA

- mają podobne aktywności jak polimeraza I, ale maksymalną aktywność

katalityczną wykazują w 75 – 80 C (Taq polimeraza ma tylko 10% maks.

aktywności w 37 C).

-szybkość reakcji w optymalnej temp. 150 dNTP/sec/cząsteczkę enzymu.

Odwrotna transkryptaza –

•RNA-zależna polimeraza DNA

Obecna w retrowirusach, gdzie kopiuje wirusowe RNA przed integracją do

genomu.

Ma dwie aktywności:

-RNA zależnej DNA polimerazy – w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje

DNA na matrycy ssRNA i ssDNA z jednakową wydajnością. W obu

przypadkach wymaga startera RNA lub DNA.

Nie ma aktywności 3’→ 5’ egzonukleazy (1/500 n jest błędny).

- Rnazy H - jest rybonukleazą, która degraduje RNA z RNA-DNA hybrydów.

Funkcjonuje zarówno jako endo- i egzonukleaza.

Najczęściej wykorzystuje się dwa różne enzymy

•z wirusa mysiej białaczki Moloneya

§z wirusa ptasiej mieloblastozy .

uzyskiwane albo przez oczyszczanie z wirusa, albo jako białka rekombinowane w

E. coli.

Zastosowanie odwrotnej transkryptazy:

0. Kopiowanie RNA na DNA np. podczas klonowania eukariotycznych genów, w

kiedy używa się mRNA jako matrycy w syntezie cDNA.

Funkcję starterów pełnią wówczas krótkie 12-18 n polimery (oligo dT),

komplementarne z ogonkami poliA mRNA.

0. Tworzenie kopii DNA z RNA przed amplifikacją PCR, w reakcji zwanej RT-PCR.

Reakcja ta jest stosowana w klonowaniu cDNA czy diagnostyce chorób – głównie

zakaźnych (wirusowych). W tym wypadku stosuje się albo startery o

przypadkowej sekwencji, albo jeśli sekwencja jest znana, startery o określonej

sekwencji.

•Terminalna transferaza

Katalizuje dodawanie nukleotydów dNTP do 3’ OH końca DNA.

Działa na ssDNA, dsDNA z wystającymi końcami (preferuje wystający koniec 3’) i mniej

efektywnie z tępymi końcami. Terminalna transferaza jest ludzkim enzymem, syntetyzowanym w limfocytach. W laboratoriach używa się enzymu izolowanego z bakterii E. coli transformowanych genem wołu. Jest to jedyna polimeraza, która nie wymaga startera i matrycy. Niezbędny jest kobalt jako kofaktor w reakcji dodawania pirymidyn lub Mg+2 w dodawaniu puryn. W odpowiednich warunkach terminalna transferaza może dodać wiele tysięcy dNTP lub tylko jeden nukleotyd jeśli jest odpowiednio zmodyfikowany np. ddNTP

Zastosowanie:

0. Znakowanie 3’ końców DNA: substratem w tej reakcji są fragmenty uzyskane po

trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi 3’ końce lub oligonukleotydy . Jeśli

taki DNA jest inkubowany w obecności znakowanych nukleotydów i terminalnej

transferazy do jego końca 3’ zostanie dodany szereg nukleotydów obecnych w

mieszaninie reakcyjnej a DNA zostanie wyznakowany.

0. Dodawanie homopolimerowych ogonków do DNA:

Stosowany np. do klonowania cDNA do plazmidów.

Terminalna transferaza pozwala na tworzenie homopolimerowych ogonków

komplementarnych do siebie w liniowych fragmentach DNA.

•Kinaza polinukleotydowa (PNK)

PNK jest enzymem, który katalizuje przeniesienie g- fosforanu z ATP na 5’ koniec DNA lub

RNA. Najczęściej stosuje się rekombinowany enzym faga T4 nadprodukowany w E. coli.

Zwykle są stosowane dwa typy reakcji : forward - w której g- fosforan z ATP jest

przenoszony na 5’ koniec defosforylowanego DNA. W reakcji wymiany – exchange, w obecności nadmiaru ADP, PNK przenosi terminalny

fosforan z ufosforylowanego DNA na ADP i ponownie przenosi radioaktywny g- fosforan z [g-32P] ATP. Reakcja typu wymiany jest mniej wydajna.

Zastosowanie:

głównie znakowanie np. radioaktywne cząsteczek DNA używanych jako sond w

hybrydyzacji oraz fosforylacja (dodawanie 5’-fosforanów) do wszelkich cząsteczek, które

ich nie posiadają np. linkerów, adapterów, starterów .

•Nukleazy (inne niż ER)

DNazy i RNazy

Dzielą się na endo- i egzonukleazy .

Ich specyficzność substratowa zależy wyłącznie od stężenia enzymu

im większe stężenie tym niższa specyficzność.

Dnazy

DNaza I - endonukleaza, tnie dsDNA i ssDNA preferencyjnie w sąsiedztwie C lub T

tworząc 5’-fosforylowane di-, tri-, i tetranukleotydy . Nie trawi RNA

Zastosowanie:

0. Usuwanie DNA z preparatów RNA;

1. Analiza interakcji DNA-białko (tzw. footprinting);

2. Nadtrawianie DNA w reakcji przesunięcia przerwy

Egzonukleaza III (E. coli)

- usuwa nukleotydy z 3’ końca dsDNA

- najlepiej działa na DNA z tępymi końcami i 5’ wystającymi. Nie działa na ssDNA.

- używana w tworzeniu określonych delecji liniowych fragmentów DNA.

Nukleaza Mung Bean– endonukleaza specyficzna dla ssDNA które trawi do do 5’-fosforylowanych mono- i oligonukleotydów.

Zastosowanie: usuwanie jednoniciowych końcówek i konwersja na tępe końce

Nukleaza BAL 31 – egzonukleaza, która trawi 3’-końce ssDNA i dsDNA zarówno

tępych jak i lepkich.

Działa też jak endonukleaza na ssDNA. Kombinacja tych dwóch aktywności umożliwia

progresywne skracanie DNA z obu końców- np. do usuwania zbędnych fragmentów

przed klonowaniem.

Nukleaza S1 (Aspergillus) - W niskich stężeniach trawi ssDNA lub RNA; w wyższych

stężeniach trawi dsDNA i dsRNA oraz DNA:RNA.

RNazy

Rybonukleaza A – endorybonukleaza, trawi ssRNA w 3’ końcu reszty pirymidynowej

Degraduje RNA do 3’ufosforylowanych mono- i oligonukleotydów

Zastosowanie rybonukleaz:

0. Usuwanie kontaminacji RNA w preparatach plazmidowego DNA

1. Mapowanie mutacji w DNA lub RNA przez cięcie niedopasowanych nukleotydów

(mismatch cleavage).