Scanned picture 205 (2) jpeg

dział poszczególnych metabolitów. Metoda HPLC znajduje sic w zbiorze metod polecanych przez Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Ze względu na konieczność posiadania kosztownej aparatury i wysoko wykwalifikowanego personelu metody te są dostępne tylko w nielicznych laboratoriach.

Wykonanie i opis ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą testu liniowego (linę test) określania aktywności witaminy D na podstawie analizy rentgenogralicznej kości oraz ocena zawartości tej witaminy w dekadowych jadłospisach przeznaczonych dla dzieci w wieku przedszkolnym.

Zasada metody oparta jest na rekalcyfikacji kości u rachitycznych szczurów. Polega ona na podawaniu młodym, rosnącym szczurom diety bez witaminy D, przez okres dwóch tygodni. Po czym wykonuje się zdjęcia rentgenowskie kości kończyn w celu określenia stopnia krzywicy. Następnie zwierzętom podaje się znane ilości standardu witaminy D (grupa kontrolna) oraz dietę o nieznanej ilości (aktywności) witaminy D (grupa badana). Po upływie 14 dni zwierzęta usypia się i wykonuje sic po raz drugi zdjęcia rentgenowskie. Stopień mineralizacji kości, będący wynikiem aktywności witaminy D, określa się na podstawie pomiaru szerokości chrząstki przynasadowej przez porównanie prób badanych ze standardami. W tym celu wykreśla się krzywe wzorcowe dla preparatów standardowych, które wyrażają zależność między dawką witaminy (wartość logarytmiczna w j.m.) a szerokością chrząstki przynasadowej podanej w centymetrach.

W ramach ćwiczenia studenci powinni:

a. Wyznaczyć aktywność witaminy D. Przeźrocza zdjęć rentgenograficz-nych kości wyświetlić na ekranie, ustawiając aparat zawsze w tej samej odległości od ekranu. Następnie zmierzyć szerokość chrząstki przynasadowej w 8 różnych miejscach. Przykładowe zdjęcie rentgenograficzne kości przedstawiono na rysunku 3.6. Chrząstka przynasadowa widziana jest jako jaśniejsze pasmo poniżej nasady kości. Dla każdego zdjęcia oraz dla tej samej grupy doświadczalnej wyznaczyć średnią wartość. W wyżej opisany sposób postępować zarówno ze zdjęciami dotyczącymi grup otrzymujących znaną dawkę witaminy D, jak i w grupie, gdzie podawano preparaty o nieznanej aktywności witaminy D. Aktywność biologiczną dla badanych preparatów wyznaczyć z krzywej standardowej.

Do wykreślenia krzywej standardowej niezbędny jest papier milimetrowy logarytmiczny lub zwykły milimetrowy z naniesioną podziałką logarytmiczną. Na ramieniu z podziałką logarytmiczną zaznaczyć dzienną dawkę witaminy D.

207