6771814992

Marcin Sieńczyk Załącznik 2

Wysoka zdolność związku 3 do inaktywacji katepsyny G oraz wysoka selektywność działania wobec innych protez serynowych umożliwiła nawiązanie współpracy z prof. Zenonem Łukaszewskim (Wydział Chemiczny Politechniki Poznańskiej) oraz dr hab. Ewą Gorodkiewicz (Wydział Chemiczny Uniwersytetu w Białymstoku), której celem było określenie użyteczności uzyskanego inhibitora do pomiarów stężenia katepsyny G w materiale biologicznym (krew, ślina).¹⁵ Zastosowanie inhibitora 3 do pomiarów metodą SPR (surface plasmon resonance) wymagało jednak przeprojektowania cząsteczki, aby umożliwić jej kowalencyjną immobilizację do podłoża. W tym celu zaprojektowałem związek zawierający terminalną grupę karboksylową (4), która następnie przy użyciu układu sprzęgającego NHS/EDC pozwoliła na związanie inhibitora z powierzchnią sensora zawierającego wolne grupy aminowe.

A,

Ponieważ wprowadzenie nawet niewielkich zmian do struktury inhibitora może powodować drastyczną zmianę aktywności, przeprowadziłem analizę wpływu obecności terminalnej grupy karboksylowej na reaktywność związku 4 z katepsyną G. Badania te rozszerzyłem o pomiar inhibicji innych proteaz serynowych m.in. ludzkiej neutrofilowej elastazy, świńskiej elastazy trzustkowej (PPE), subtylizyny oraz proteinazy 3. Analiza wyników wykazała, że istotnie, aktywność związku 4 wobec katepsyny G zmniejszyła się około pięciokrotnie (k₀j,_s/I = 52 500 M^-1s^-1) w porównaniu z inhibitorem 3, natomiast aktywność wobec trypsyny zmalała ponad czterokrotnie, przy czym związek 4 nie hamował aktywności HNE, PPE oraz chymotrypsyny. Interesującym jest, że selektywność działania 4 wobec trypsyny uległa tylko nieznacznej zmianie — był on około 17 razy mniej reaktywny w stosunku do trypsyny niż katepsyny G. Zaprojektowany sensor pozwolił na bardzo czułą detekcję CatG w ślinie i surowicy pacjentów,¹⁵ a także umożliwił detekcję katalitycznie aktywnej katepsyny G u pacjentów cierpiących na endometriozę.¹⁶

Kontynuując moje badania nad zastosowaniem inhibitorów katepsyny G w analizie roli tej proteazy w układach biologicznych, rozpocząłem współpracę naukową z prof. Timo Bursterem {Dimsion of Endocńnology and Diabetes, Department of Intemal Medicine I, Uniuersity Medi-cal Center Ulm, Niemcy). Jako że katepsyna G, obok proteaz cysternowych (np. katepsyny S) i proteaz aspartylowych (np. katepsyny D), bierze udział m.in. w regulacji procesowania autoan-

¹⁵    [H.10] Gorodkiewicz E., Sieńczyk M., Regulska E., Grzywa R., Pietrusewicz E., Lesner A., Łukaszewski Z.: Surface plasmon resonance imaging biosensor for cathepsin G based on a potent inhibitor: deuelopment and applications, Anal. Biochem., 2012, 423, 218-223.

¹⁶    [H.15] Grzywa R., Gorodkiewicz E., Burchacka E., Lesner A., Laudański P., Łukaszewski Z., Sieńczyk M.: Determination of cathepsin G in endometrial tissue using a surface plasmon resonance imaging biosensor with tailored phosphonic inhibitor, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 2014, 182, 38-42.