6771814996

Marcin Sieńczyk Załącznik 2

detekcji aktywnej katepsyny G w lizacie śledziony wołowej,²³ potwierdzając tym samym wyniki pionierskich prac na temat izolacji enzymów proteolitycznych, których autorem był Sven Gustaf Hedin.²⁴ Związek 8 okazał się doskonałym narzędziem do analizy aktywności katepsyny G na różnych etapach jej izolacji. Uzyskane wyniki pozwoliły mi na zaprojektowanie i syntezę serii nowych sond molekularnych do detekcji zarówno neutrofilowych proteaz serynowych (katepsyny G, ludzkiej elastazy, proteinazy 3), jak i chymotrypsyny, trypsyny, subtylizyny czy świńskiej elastazy trzustkowej.²⁵ Dalsza optymalizacja struktury związków pozwoliła otrzymać pochodną, która wykazała absolutną selektywność działania wobec katepsyny G, nie reagując ani z neutrofilową elastazą, ani z proteinazą 3.²⁶ Choć przeprowadzone badania kinetyczne wykazały absolutną selektywność działania pochodnej 9 wobec CatG (k„j,_s/I = 3 800 M^-1s^-1), analiza Western biot pokazała jednak niewielką reaktywność związku 9 z ludzką neutrofilową elastazą, co może być skutkiem niespecyficznych oddziaływań cząsteczki inhibitora z proteazą (Rys.4). Spośród wszystkich pochodnych tej serii absolutną selektywność działania wobec ludzkiej katepsyny G w teście Western biot wykazał związek 11 będący biotynylowaną pochodną otrzymanego wcześniej inhibitora 4. Na uwagę zasługuje fakt, iż wprowadzenie do struktury związku 4 biotyny skutkował około 200-krotnym obniżeniem jego właściwości inhibitorowych (k₀(,_s/I = 240 M^-1s^-1) wobec CatG, przy jednoczesnym wzroście selektywności działania wobec proteinazy 3. Badania zdolności otrzymanych sond molekularnych do detekcji HNE, CatG i PR3 w teście Western biot wykazały, iż najwyższy poziom specyficzności wobec CatG wykazywały pochodne zawierające z pozycji PI fosfonowy analog fe-nyloalaniny lub 4-guanidynofenyloglicyny, natomiast pochodne fosfonowych analogów alaniny czy leucyny tworzyły stabilne kompleksy ze wszystkimi badanymi proteazami (Rys.4).

W kolejnym etapie prac wykorzystałem otrzymane sondy molekularne do badania aktywności katepsyny G zarówno w żywych komórkach, jak i w lizatach ludzkich komórek PBMC oraz lizatach śledzion ewolucyjnie odległych organizmów (Rys.4) Wyniki przeprowadzonych badań pokazały, iż sondy molekularne zawierające reagujący z miejscem aktywnym docelowej proteazy fosfonowy analog aminokwasu stanowią użyteczne narzędzie do badania neutrofilowych proteaz, w szczególności katepsyny G, co zostało wykazane zarówno przy użyciu czystych enzymów, jak i skomplikowanych

²³    [H.6] Palesch D., Sieńczyk M., Oleksyszyn J., Reich M., Wieczerzak E., Boehm B.O., Burster T.: Was the serine protease cathepsin G discovered by S. G. Hedin in 1903 in bovine spleen? Acta Biochim. Pol., 2011, 58, 39-44.

²⁴    a) Hedin S.G.: Investigations on the proteolytic enzymes of the spleen of the ox, J. Physiol., 1903, 30, 155-175; b) Hedin S.G.: On the presence of a proteolytic enzyme in the normal serum of the ox, J. Physiol., 1903, 30, 195-200.

²⁵    a) Sieńczyk M., Grzywa R., Pietrusewicz E., Oleksyszyn J., Winiarski Ł., Burster T., Bohm O.: Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofo Jonowych, sposób wytwarzania estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofofonowych oraz ich zastosowanie, Zgłoszenie Patentowe P399613; b) Sieńczyk M., Grzywa R., Pietrusewicz E., Oleksyszyn J., Winiarski Ł., Burster T., Bohm O.: Derivatives of 1-aminoalkylphosphonate diaryl esters, method of 1-aminoalkylphosphonate diaryl ester derivatives preparation and their application, Europejskie Zgłoszenie Patentowe 13172944.4-1451.

²⁶    [H.14] Grzywa R., Burchacka E., Łęcka M., Winiarski Ł., Walczak M., Łupicka-Słowik A., Wysocka M., Burster T., Bobrek K., Csencsits-Smith K., Lesner A., Sieńczyk M.: Synthesis of novel phosphonic-type activity-based probes for neutrophil serine proteases and their application in spleen lysates of different organisms, ChemBio-Chem, 2014, DOI: 10.1002/cbic.201402360.