6771814995

Marcin Sieńczyk Załącznik 2

W ramach kontynuacji podjętych badań dotyczących roli katepsyny G zaprojektowałem i zsyn-tetyzowałem biotynylowaną pochodną Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phe^p(OPh)2 (MARS-116, 8), którą wykorzystałem m.in. do detekcji katepsyny G w łizatach komórek PBMC, limfocytów B, mie-loidalnych komórek dendrytycznych (mDCl) oraz plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC).²² W trakcie prowadzonych analiz wykazałem, że związek 8 zdolny był do detekcji katepsyny G nawet w niewielkiej ilości lizatu komórek (zaledwie kilka mikrogramów), co w porównaniu do komercyjnie dostępnej sondy DAP22c, w przypadku której konieczne jest użycie przynajmniej 20 pg lizatu, stanowi istotny wzrost czułości detekcji tej proteazy. W przeprowadzonych badaniach wykazałem także, że transformacja komórek PBMC wirusem EBV (wirus Epstein-Barr) znacznie redukuje ilość aktywnej katepsyny G w pierwszych pięciu dniach inkubacji, a w 12 dniu jest już ona niewykrywalna w lizacie komórkowym. Od 12 dnia wykazano obecność specyficznych białek wirusa EBV takich jak EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen), co potwierdza skuteczność infekcji. Co więcej, ilość białek MHC klasy II limfocytów B uległa redukcji na skutek transformacji wirusem EBV. Prawdopodobnie regulacja aktywności endocytarnych katepsyn może być jedną ze strategii wirusa EBV na ucieczkę przed układem immunologicznym człowieka.

Otrzymana sonda molekularna specyficzna względem katepsyny G posłużyła także do konstrukcji hybrydowego testu ELISA, nazwanego w skrócie CASSIA (colorimetric active-site speci-fic immunoassay). Stosowane powszechnie testy immunoenzymatyczne wykorzystujące specyficzne przeciwciała nie są zdolne do identyfikacji wyłącznie aktywnych form enzymu — wykrywają najczęściej wszystkie jego formy (aktywne i nieaktywne katalitycznie), jak i możliwe produkty degradacji. Opracowany test CASSIA pozwolił na detekcję wyłącznie aktywnej katepsyny G. Analizowana próbka (lizat komórkowy lub czysta katepsyna G) po inkubacji ze związkiem 8 została naniesiona na 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczoną przeciwciałem specyficznym wobec CatG. Dodanie w kolejnym etapie czynnika detekcyjnego (streptawidyna-HRP) pozwoliło na uzyskanie specyficznego sygnału pochodzącego jedynie od aktywnej enzymatycznie CatG. Jako że w przypadku wielu chorób obserwuje się wzrost ekspresji proteaz, ważne jest uzyskanie informacji na temat poziomu ich aktywności. Opracowane narzędzie hybrydowego testu ELISA do detekcji katepsyny G może mieć więc istotny charakter aplikacyjny. Związek 8 wykorzystałem także do ²² [H.9] Zou F., Schmon M., Sieńczyk M., Grzywa R., Palesch D., Boehm B.O., Sun Z.L., Watts C., Schirm-beck R., Burster T.: Application o}a novel highly sensitine activity-based probe for detection of cathepsin G, Anal. Biochem., 2012, 421, 667-672.

— 15 —