6771814994

Marcin Sieńczyk Załącznik 2

dendrytyczne, mDCl) zastosowałem specyficzne inhibitory katepsyny G. W tym celu zaprojektowałem i otrzymałem związek 6 będący metylowym estrem pochodnej Suc-Val-Pro-Phe^f>(OPh)2, który wykazywał zwiększoną zdolność wnikania do komórki. W pierwszym etapie potwierdziłem zdolność pochodnej 6 do hamowania endogennej katepsyny G w świeżo wyizolowanych komórkach PBMC, który okazał się około pięciokrotnie silniejszym inhibitorem katepsyny G, w porównaniu ze związkiem 5, co może być konsekwencją jego zwiększonej zdolności penetracji komórek. Choć wyniki przeprowadzonych badań nie potwierdziły roli katepsyny G w pierwszych etapach degradacji Ii w komórkach B czy mDCl, a podobny profil produktów degradacji Ii zaobserwowałem zarówno po zastosowaniu inhibitora proteaz cysteinowych o szerokim spektrum działania (E64d), jak i dla mieszaniny E64d z inhibitorami katepsyny G, to zastosowane inhibitory katepsyny G pozwoliły po raz pierwszy wykazać brak różnic w proteolizie Ii w żywych komórkach B, mDCl oraz limfoblastoidalnych komórkach B.

Oprócz podstawowego zastosowania estrów diarylowych kwasów 1-aminolkilofosfonowych jako inhibitorów proteaz serynowych w badaniach funkcji enzymów czy poszukiwaniach nowych potencjalnych terapeutyków, znalazły one praktyczne zastosowanie jako niskocząsteczkowe sondy molekularne (ABP, activity-based probes) pozwalające na detekcję aktywnych form docelowych proteaz nie tylko w badaniach in vitro, ale także umożliwiły śledzenie ich aktywności w żywych komórkach. Pionierem w projektowaniu i syntezie fosfonowych sond molekularnych był prof. James Powers, który już kilka lat po opublikowaniu pierwszego doniesienia na temat właściwości inhibitorowych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych wskazał zastosowanie N-terminalnie fluorescencyjnie znakowanych fosfonopeptydów do detekcji granzymów w żywych cytotoksycznych limfocytach T.²⁰ Do chwili obecnej otrzymano szereg fosfonowych niskocząsteczkowych sond molekularnych do detekcji wielu proteaz serynowych.^11,21 Co ciekawe, brak jest jednak informacji na temat projektowania ABP do detekcji katepsyny G. Handlowo dostępna jest pochodna Bt-Ala-Ala-Phe^p(OPh)2 (DAP22c, 7), jednakże specyficzność jej działania jest dość szeroka reagując z różnymi chymotrypsynowymi proteazami serynowymi.

²⁰    Abuelyaman A.S., Jackson D.S., Hudig D., Woodard S.L., Powers J.C.: Synthesis and kinetic studies of diphenyl l-(N-peptidylamino)alkanephosphonate esters and their biotinylated derivatives as inhibitora of serine proteases and probes for lymphocyte granzymes, Arch. Biochem. Biophys., 1997, 344, 271-280.

²¹    a) Gilmore B.F., Quinn D.J., Duff T., Cathcart G.R., Scott C.J., Walker B.: Expedited solid-phase synthesis of fiuorescently labeled and biotinylated aminoalkane diphenyl phosphonate affinity probes for chymotrypsin- and elastase-like serine proteases, Bioconjug. Chem., 2009, 20, 2098-2105; b) Dvorak J., Mashiyama S.T., Braschi S., Sajid M., Knudsen G.M., Hansell E., Lim K.C., Hsieh I., Bahgat M., Mackenzie B., Medzihradszky K.F., Babbitt P.C., Caffrey C.R., McKerrow J.H.: Differential use of protease families for inoasion by schistosome cereariae, Biochimie, 2008, 90, 345—358; c) Mahrus S., Craik C.S.: Selective Chemical functional probes of granzymes A and B reveal granzyme B is a major effector of natural killer cell-mediated lysis of target cells, Chem. Biol., 2005, 12, 567-577; d) Serim S., Mayer S.V., Verhelst S.H.: Timing activity-based probe selectivity for serine proteases by on-resin ’click’ construction of peptide diphenyl phosphonates, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5714-5721; e) Gilmore B.F., Carson L., McShane L.L., Quinn D., Coulter W.A., Walker B.: Synthesis, kinetic enaluation, and utilization of a biotinylated dipeptide proline diphenyl phosphonate for the disclosure of dipeptidyl peptidase IV-like serine proteases, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 3ĄT, 373-379.