puszki 2.10.2014 cwiczenie 1
Badanie chemiczne
ustawa z dnia 25.08.2006 o bezpieczenstwie zywnosci i zywienia
rozp MRiRW 10.07.2007 w spr znakowania srodkow spozywczych
rozp Ministra Zdrowia 25.07.2007 w spr sposobu znakowania zywnosci wartoscia odzywcza
rozp MZ 22.11.2010 w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych (nieaktualne)
Chemiczne badania sanitarne zywnosci maja na celu:
1. okreslenie poziomu skladnikow podstawowych /bialko ogolne, tluszcze, woda/, decydujacych o wartosci odzywczej srodkow spozywczyc
- ewentualne odchylenia od skladu naturalnego lub norm, wskazywac moga na zafalszowania
2. stwierdzeie obecnosci i poziomu substancji obcych, wprowadzanyh celowo do zywnosci jako dozwolone subs dodatkowe p azotany azotyny i inne, lub bedacych wynikiem zanieczyszczen technicznych ew. przypadkowych np matal
- obecnosc tych zwiazkow jako subs toksycznych moze byc w srodkach spozywczych w ogole niedozwolona lub tez limitowana okreslonym dopuszczalnym maksymalnym poziomem.
Badania chemiczne zywnosci wyk przez sluzbe san-wet:
- zawartosc bailka ogolnego
- zaw bialek lacznotkankowych (tk lacznej)
- zaw tluszczu
- wody
- popiolu
- wartosc pH
- soli kuchennej
- wykrywanie obecnosci skrobi
- zaw azotynow i azotanow
- zaw fosforu
- zaw kwasu benzoesowego i jego soli sodowej
- kwasu sorbowego oraz jego soli sodowej, potasowej, wapniowej
- metali (ciezkich): Cd, Pb, As, Hg, Cu, Zn, Sn, Fe
- wg wykazu dopuszczalnych zanieczyszczen technicznych i ich ilosci w srodkach spozywczych i uzywkach
Pn-75/A-04018 produkty rolno-spozywcze. Oznaczanie azotu met Kjeldahla i przelicanie na bialko.
PN-ISO 3496:2000 Mieso i przetwory miesne. Oznaczanie zawartosci hydroksyproliny.
PN-ISO 1444:2000 Mieo i przetwory miesne. Oznaczanie zawartosci tluszczu wolnego.
itd.
Badania chemiczne zywnosci wykonuje sie
1.zgodnie z planem (raz na kwartal, raz na pol roku itd)
2. odwolawcze
3. zmiana i naprawa urzadzen, maszyn (nowe urzadzenia)
4. zmiana skladnikow w produkcie
5. produkt wprowadzony pierwszy raz na rynek
WARTOSC ENERGETYCZNĄ W ŻYWNOSCI PODANO W:
1kJ = 0,239 kcal
1kcal = 4,184kJ
energetyczne wspolczynniki przeliczeniowe dla:
1g bialka -17kJ-4kcal
1g tluszczu - 37kJ-9kcal
1 g weglowaodnow - 17kJ-4kcal
Zawartoc bialka ogolengo - met Kjeldahla
ogolen wyliczenie azotu, ktora przelicza sie na bialko
wspolczynnik przeliczeniowy dla bialek zwierzecych wynosi 6,25
16% zotu zawierza bialko zwierzece
%bialka = a x 0,0014 x 6,25 x 100 / b
a - iloscml 0,1n kwasu solnego zuzytego do miareczkowania
0,0014 - ilosc azotu odpowiadajaca 1ml 0,1n kw solnego w gramach
100 - przeliczenie na %
b - waga odwazki, w gramach
Zawartosc bialek lacznotkankowych
zawartosc bialek lacznotkankowych (kolagenu) ma istotne znaczenie w okreslaniu wartosci biologicznej bialek miesa.
Metoda oznaczania kolagenu wg. Stegemanna i Staldera opiera sie na ilosciowych oznaczeniu hydroksyproliny, aminokwasu charakterystycznego dla kolegenu, ktory nie wystepuje w miesniowym bialku wlokienkowym, a jest obecny w bardzo niewielkiej ilosci w elestynie
zawartosc kolegenu = zawartosc hydroksyproliny x 8
zawartosc aminokwasow niezbednych egzogennych w bialku wzorcowym przyjetym przez komitet ekspertow
(G/100G bialka)
izoleucyna 2,8
leucyna 6,6
izyna 5,8
metionina +cystyna 2,5
fenyloalanina + tyrozyna 6,3
treonina 3,4
tryptofan 1,1
walina 3,5
razem 32,0
dla dzieci od 2 do 12 lat dla doroslych
Zawartosc tluszczu - met ekstrakcyjna (odwolawcza) w aparacie Soxhleta
X = m1 - m2 / m0 x100
m1 - masa kolby destylacyjnej z perelkami z wyekstrahowanym tluszczem w gramach
m2 - masa kolby destylacyjnej z perelkami przed ekstrakcja, w gramach
m0 - masa probki przed suszeniem , w gramach
za wynik przyjac srednia arytmetyczna wynikow w dwoch oznaczen, podac z dokladnoscia do 0,1%
Zawartosc kasow tluszczowych
1. nasyconych
2. jednonienasyconych
3. niezbednych nienasyconych kwasow tluszczowych (NNKT)
NNKT
kw. linolowy C18:2 n6 6,9
kw. linolenowy C18:3 n3 3,6,9
kw. arachidonowy C20:4 n6 6,9,12,15
kw. eikozapentaenowy /EPA/ C20:5 n3 3,6,9,12,15
kw. dokozaheksaenowy /DHA/ C22:6 n3 3,6,9,12,15,18
Analiza kwasow tluszczowych - w chromatografie gazowym
Zaw. wody - met odwolawcza suszenie probki w temp 105C az do uzyskania stalej masy probki
x = m1-m2 / m1-m0 x100
m1 - masa naczynka wagowego z piaskiem i precikiem szklanym oraz probki przed suszeniem w gramach
m2 - masa naczynka wagowego z piaskiem, precikiem szklanym i probka po wysuszeniu , w g
m0 - masa naczynka wagawego z piaskiem i precikiem szklanym, w g
Sol kuchenna
- met Mohra - ekstrakcja soli goraca woda i zmiareczkoweanie chlorkow azotanem srebra - przy obecnosci chromianu potasowego jako wskaznika
zawartosc azotynow i azotanow
- wg rekacji barwnej azotanow i azotynow przy pomocy odczynnika Griessa
Zaw fosforu
- wytracenie fosforu w postaci fosforomolibdenianu chinoliny - pomiar wagowy
Obecnosc skrobi
- plyn Lugola - w obecnosci skrobi zabarwi sie na niebiesko
Zaw. metali ciezkich
- spektrofotometria adsorpcji atomowej
Wyniki wpisac do ksiazki badan chemicznych
Cwiczenia 23.10.2014
Salmonella
Schemat izolacji paleczek Salmonella
1. Przednamnazanie
Probka (25g lub ml) + 225 ml zbuforowanej wody peptonowej o temp otoczenia
Inkubacja 37+- 1 oC, 18+-2h
2. Namnazanie selektywne (rownolegle)
a) 0,1 ml hodowli + 10ml pozywki Rapaport-Vasiliadis (RVS)
Inkubacja 41,5 +- 1oC, 24+-3h
b) 1ml hodowli +10ml pozywki Muller-Kauffmanna z czterotionianem i nowobiocyna (MKTTn)
Inkubacja 37+-1oC, 24+-3h
3. Przesiew na stale pozywki selektywne (rownolegle)
a) POzywka XLD
b) Do wyboru np: SS lub BPLS lub Hektoena lub z siarczanem bizmutowym
Inkubacja 37 +- 1oC, 24 +-3h
4. Potwierdzenie (i jednych i drugich)
Selekcja 5 charakterystycznych kolonii z kazdej plytki
Przesiew na agar odzywczy , inkubacja 37 +- 1 oC, 24 +- 3h
(rownolegle)
a) badania biochemiczne (TSI, V-P, ureaza, lizyna, indol, beta-galaktozydaza)
b) badania serologiczne(antygeny : O, Vi, H)
5. interpretacja wynikow
XLD:
- z ksyloza i lizyne
- czarne srodki, sa otoczone lekka przezroczysta strefa koloru jasnoczerwonego
Salmonella-Shigella (SS)
- drobne, wypukle kolonie o rownych brzegach, koloru pozywki lub bardziej zolte, dy duze ilosci H2S srodek kolonii moze byc zaczerniony
BGA: (BPLS)
- tworza bezbarwne kolonie i zmieniaja barwe z amarantowej na czerwonawa (podloza)
Hektoena:
- typowe: nie fermentuja laktoze sa niebieskozieolone, z czarnym luz bez srodka,
-fermentujace: (nietypowe) sa rozowe
z siarczyne bizmutawym:
- czarne lub brazowe kolonie o metalicznym polysku, otoczone brunatno-szara strefa
Profil biochemiczny Salmonella:
1. fermentacja glukozy z wyt. kwasu (100% szczepow) -zazolcenie slupka na podlozu trojcukrowym z cytrynianem zelaza (TSI)
2. fermantacja z wyt. gazu (91,9%) - pecherzyi gazu w slupku lub rozerwane podloze TSI
3. wyt H2S (91,6%) - zaczernienie slupka lub ciemny pierscien na granicy slupka i skosu podloza TSI
4. brak zdolnosci fermentacji laktozy i sacharozy (99,2 i 99,5%) - czerwona barwa skozu i podloza TSI
5. dekarboksylacja lizyny (94,6%) - zmiana barwy podloza n afioletowo-purpurowa
6. brak zdolnosci wyt ureazy (100%) nieznienona z zoltej na czerwnono fioletowa barwa podloza z mocznikiem wg Christensena
7. brak zdolnosci wytwarzania beta-galaktozydazy (98,5%) - niezmieniona (fioletowa) na zolta barwa podloza
8. brak zdolnosci wyt indolu (98,9%) - po akropleniu odczynnika Kovacsa na pozywke z tryptofanem nie pojawia sie fioletowe zabarwienie na grnanicy faz
9. brak zdolnosci wyt acetylometylokarbinolu (acetoiny - 100%) niezabarwiona na czerwono gorna czesc zawartosci probowki w tescie Voges-Proskauera (VP)
Badanie serologiczne drobnoustrojow rodzaju Salmonella odczynem aglutynacji szkielkowej:
1. ykluczenie szczepow zdolnych do autoaglutynacji
2. Badanie na obecnosc antygenu somatycznego (O)
3. badanie na obecnosc antygenu otoczkowego (Vi)
4. badanie na obecnosc antygenu rzeskowego (H)
Schemat izolazcji gronkowcow
Posiew po 1ml (z kazdego rozcienczenia) do 3 probowek z 9ml podloza Giolitti-Cantoni (G-C), zalanie podloza 2-3cm warstwa uplynionego agaru, inkubacja w 37 przez 24-48h
Posiew 1 kropli materialu z dna probowki z podloza G-C wykazujacego wzrost gronkowcow (szary lub czarny osad lub zaczernienie calego podloza) na podloze Baird-Parkera, inkubacja w 37 przez 24-48h (pierwsze sprawdzenie posiewow po 24h)
Posiew 5 podejrzanych kolonii (czarne, czesto ze stalowym odcieniem, okragle kolonie, najczesciej z waskim, prozezroczystym brzegiem; szczepy wytwarzajace lipaze tworza kolonie otoczone matowa lub przejrzysta strefa zmienionej pozywki) na pozywke z wyciagiem mozgowo-sercowym (BHI) i inkubacja w 37, przez 24+-2h
a) ew. proby na zdolnosc wyt katalazy i fermentacje glukozy w warunkach beztlenowych
b) proba na zdolnosc wytwarzania koagulazy: 0,3ml plazmy kroliczej + 1ml hodowli na BHI -> inkubacja w 37 do 6h. Wynik dodatni: objetosc skrzepu wynosi wiecej niz polowe wyjsciowej objetosci
Wykrywanie bakterii Listeria monocytogenes
Schemat postepowania
Probka badana (x g lub x ml)
1. pozywka do wstepnego namnazania (bulion pOl - Frasera) ->
inkubacja 30C przez 24h +- 3h
->
a) posiew 0,1ml hodowli do 10ml grugiej pozywki namnazajacej (bulon Fishera)
-> inkubacja w temp 35C lub 37C przez 48 +-3h
-> posiew na plytki z pozywka agarowa Listeria wg Ottaviani i Agosti (ALOA) i druga pozywke selektywna
-> inkubacja pozywki agarowej Listeria wg Ottaviani i Agosti przez 24h +- 3h i jesli to jest konieczne, dodatkowo przez 24h +- 3hw temp. 37C , inkubacja drugiej selektywnej pozywki zgodnie z wbrana pozywka i w warunkach podatnych przez prodcenta
-> potwierdzenie
b) posiew na plytki
-> pozywka agarowa Listeria (ALOA) i druga pozywka selektywna
-> inkubacja pozywki agarowej
........ glupi program !!!!!!!!!!!!!!!!
Bacillus cereus
oznaczanie libczy
- posiew z poszczeglnych rozcienczen na 2 plytki z pozywka kompletna (MYP) w sklad ktorej wchodza pozywka podstawowa, rztwor polimyksyny B i emulsja zoltka jaja. Inkubacja 30C /18-24h w razie potrzeby przedluzamy o nastepne 24h
- bakterie Bacillus cereus rosna w postaci uzych rozowych kolonii ze sterfa zmetnienia
- liczymy plytki z dwoch kolejnych rozcienczen na ktorych jest nie wicej niz 150 kolonii, podstawiamy do wzrou, lb drobnoustrojow podajemy na g lub ml
Testy potwierdzajace
a. test na hemolize - (+)
b. fermentacja mannitolu z wyt kawasu (rozowa barwa kolonii moze zostac oslabiona lub moze nastapic calkowite odbarwienie)
c. wyt lecytynazy (tylko niektore szczepy, kolonie takich szczepow nie sa otoczone strefa zmetanienia , powinny byc rozniwe poddane testom potwierdajacy,)
Clostridium perfringens
oznaczanie lb
- posiew z poszczegonych rozcienczen na 2 plytki z pozywka kompletna w sklad ktorej wchodza pozywka podstawowa z siarczanem (IV) i roztwor cykloseryny (SC) . inkubacja 37C przez 20h w warunkach beztlenowych w anaerostacie.
- bakteie rosna w postaci kolonii otoczonych czarna strefa precypitatu, spowodowanego redukcja siarczanow do siarczkow, co powoduje zaczernienie kolonii
- liczymy plytki z dwoch kolejnych rozcienczen na ktoryc jest nie wiecej jak 150 kolonii, podstawiamy do wzoru , lb w g lub ml
esty potwierdzajace:
a. test redukcji azotanow do azotynow - (+)
b. fermentacja laktozy z wyt gazu i kwasu
c. rozpuszczenie zelatyny
d. brak zdolnosci ruchu
Wkrywanie Camplylobacter
1 okresolna ilosc probki x zmieszac z dziewieciokrotna (9x) objetoscia plynnej pozywki namnazajacej bulion Boltona, aby otrzymac stosunek wielkosc nawazki/pozywka namnazajaca 1:10
2. prowadzic inkubacje w atmosferze mikroaerofilnej w 37C / 4-6h, a nastepnie w temp 41,5C/ 44+/- 4h
3. hodowle otrzymana na pozywce namnazajacej posiac jalowa eza na powierzchnie pierwszej selektywnej pozywki agarowej mCCDA. Wykonac takie same czynnosci na drugiej pozywce selektywnej wybranej do izolowania Campylobacter np: Agar Skirrow, Agar Karmali, Agar Prestona
4. inkubowac posiane plytki w temp 41,5C w atmosferze mikroaerofilnej przez 44 +/- 4 h
5. po inkubacji sprawdzc na plytce obecnosc typowych ub podejrzanych kolonii. Typowe kolonie na mCCDA sa szarawe, czesto z metalicznym plyskiem, plaskie wilgotne z tendencja do rozlewajacego wzrostu.
6. potwierdzenie gat CAmpylobacter do badan potwierdzajacych wybrac z kazdej posianej plytki z pozywka selektywna przynajmniej jedna typowa lub podejrzana kolonie i posiac na pozywke agarowa Columbia z krwia w celu uzyskania pojedynczych oddzielnych kolonii. Posiane plytki inkubawac 41,5C. mikroaerofilne/ 24-48h
7. badanie cech morfologicznych i zdolnosci ruchu- material pobrany z jednej kolonii wyroslej na pozywce agarowej Columbia z krwia zawiesic w 1ml bulionu Bucella, a nastepnie sprawdzic pod mikroskopem cechy morfologiczne i zdolnosc uchu. Do dalszych badan przeznaczyc wszystkie uprzednio przygotowane zawiesiny w ktorych wykazano obecnos przecinkowatych , zakrzywionych poleczek, majacych ponadt..................
10. wykona test na wykrywanie oksydazy.
podsumowanie
ruchliwosc
wzrost w mikrofilnej atmosferze w temp 25........