Wpływ czynników genetycznych na skuteczność i bezpieczeństwo farmakoterapii - informacje wstępne

Autorzy

Prof. dr hab. Barbara Gawrońska-Szklarz

---

Definicja farmakogenetyki

Od dawna już obserwowano, że po podaniu tego samego leku, w tej samej dawce, osobom leczonym z powodu tej samej choroby, u niektórych osób stwierdzano brak efektu terapeutycznego, a u innych wystąpienie działań niepożądanych. Odnosiło się to zarówno do pojedynczych pacjentów, jak i do określonych grup w populacji, która odmiennie zareagowała na podany lek aniżeli reszta ludności. Badania prowadzone bardzo intensywnie od lat siedemdziesiątych wykazały, że takie nieoczekiwane działanie leków może być często uwarunkowane czynnikami dziedzicznymi, a w szczególności genetycznie uwarunkowaną aktywnością enzymów metabolizujących leki. Odkrycie to zapoczątkowało rozwój nowej dziedziny nauki – farmakogenetyki. Po raz pierwszy definicję farmakogenetyki podał Vogel (1959r), definiując ją jako naukę o dziedzicznie uwarunkowanych różnicach w szybkości metabolizowania leków. Obecnie wiadomo, że przyczyną zmienionej reakcji na podany lek może być nie tylko aktywność enzymów metabolizujących leki, dlatego też przyjęto szerszą definicję podaną w 2001 roku przez Meyer’a. Według tej definicji farmakogenetyka jest to nauka, która zajmuje się badaniem czynników genetycznych wpływających na zmienioną odpowiedź na lek.

 

Ryc.1. Definicja farmakogenetyki.

 

Polimorfizm genetyczny

Po raz pierwszy w warunkach klinicznych zwrócono uwagę na tego rodzaju zjawiska po wprowadzeniu do stosowania w anestezjologii sukcynylocholiny jako środka zwiotczającego mięśnie. Krótkotrwałe, zazwyczaj kilkuminutowe, działanie sukcynylocholiny jest uwarunkowane szybką hydrolizą leku przez odpowiednią esterazę cholinową (pseudoesteraza cholinowa) występującą w surowicy i w wątrobie. U pojedynczych pacjentów (w 1 przypadku na 3000 osób) po podaniu standardowych dawek tego leku blokada nerwowo-mięśniowa przedłuża się nawet do 3 godzin, co z powodu całkowitego porażenia mięśni, w tym również oddechowych, stwarza niebezpieczeństwo dla życia chorego, któremu podano lek. Przyczyną przedłużonego działania sukcynylocholiny jest obecność w surowicy atypowej pseudocholinoesterazy, o znacznie mniejszym powinowactwie do tego leku i znacznie wolniej rozkładającego sukcynylocholinę. U tych osób 1/60 standardowej dawki sukcynylocholiny wywołuje takie samo działanie, jak pełna dawka leku u osób z prawidłową aktywnością enzymu.

Podobne zjawisko, ale dotyczące znacznie większej liczy osób, obserwowano po wprowadzeniu do leczenia leku przeciwgruźliczego izoniazydu. U około połowy osób leczonych standardową dawką izoniazydu rzadziej występowały remisje, częstsze były nawroty choroby i oporność na leki, a u innych skuteczność terapii była zadawalająca, ale znacznie częściej występowały toksyczne powikłania polekowe, np. uszkodzenie wątroby i neuropatie po stosowaniu izoniazydu. Jak się okazało, przyczyną obserwowanych zjawisk są genetycznie uwarunkowane różnice w aktywności N-acetylotransferazy (NAT2), enzymu metabolizującego izoniazyd na drodze acetylacji.

Badania na poziomie molekularnym mające na celu wyjaśnienie odmiennego działania farmakologicznego tego samego leku u niektórych osób wykazały, że u podłoża tych różnic leży polimorfizm genetyczny. Według definicji polimorfizmu genetycznego różnice w aktywności spowodowane są dziedziczeniem różnych alleli tego samego genu, które zajmują to samo miejsce w genomie (locus). Oznacza to, że w takim samym miejscu w genomie u poszczególnych osób występują różne sekwencje DNA (genotypy). W wyniku tego powstaje wiele fenotypów. Aby wykluczyć rzadko występujące genetycznie uwarunkowane enzymopatie (np. występowanie u 1/3000 osób atypowej pseudocholinoesterazy) w przypadku polimorfizmu genetycznego częstość występowania najrzadziej pojawiającego się allelu powinna wynosić 1-2%. Jeżeli ta częstość jest znacznie mniejsza wówczas mówimy, że jest to cech rzadka, a nie polimorfizm genetyczny.

 

Ryc. 2. Polimorfizm genetyczny.

 

W związku z występowaniem polimorfizmu genetycznego enzymów biorących udział w procesach biotransformacji leków i innych ksenobiotyków w organizmie, w danej populacji można wyróżnić fenotypowo odmienne grupy np. osoby z fenotypem szybkiego metabolizowania (EM-extensive metabolizers), osoby z defektem genetycznym, które źle lub słabo metabolizują niektóre leki (PM-poor metabolizers) oraz osoby bardzo szybko metabolizujące tzw. ultra-szybkich metabolizerów (UM). Częstość występowania tych fenotypów jest odmienna u poszczególnych ras i grup etnicznych. Za fenotyp wolnego metabolizowania niektórych leków (PM) odpowiada homozygotyczny genotyp składający się z dwóch zmutowanych alleli warunkujących cechę upośledzonego metabolizmu. Natomiast za fenotyp szybkiego metabolizowania (EM) odpowiada genotyp homozygotyczny dominujący (dwa allele prawidłowe tzw. dzikie – wt)). Osoby posiadające genotyp heterozygotyczny (jeden allel prawidłowy i jeden allel zmutowany) mogą charakteryzować się zmniejszoną lub prawidłową aktywnością w zależności od badanego enzymu. Ultra-szybki fenotyp związany jest z występowaniem kilku lub kilkunastu kopii tego samego genu (multiplikacja genu) u jednej osoby. U osobników wolno metabolizujących obserwuje się kumulację leków, nasilone działanie farmakologiczne, ale też częściej występują działania niepożądane, a nawet toksyczne. Osoby posiadające kilka lub kilkanaście kopii tego samego genu wymagają znacznie większych dawek leku dla zapewnienia efektu terapeutycznego. Wykrycie genetycznie uwarunkowanych różnic w aktywności enzymów metabolizujących leki pozwoliło na wyjaśnienie osobniczych różnic w odpowiedzi na ten sam lek w danej populacji oraz między różnymi rasami i grupami etnicznymi. Jest to związane bezpośrednio ze stężeniami leku w płynach biologicznych i jego parametrami farmakokinetycznymi.

 

 

 

 

Ryc. 3. Stężenia nortryptyliny w zależności od genotypu CYP2D6.

 

Na rycinie 3 przedstawiono stężenia nortryptyliny w zależności od genotypu CYP2D6 odpowiedzialnego za utlenianie nortryptyliny. U osobników (PM) nie posiadających aktywnego genu CYP2D6 (0 kopii prawidłowego genu) stężenie jest najwyższe, często przekraczające minimalne stężenie toksyczne. Odwrotnie, u osób posiadających kilka kopii tego genu (ultra-szybki metabolizm), stężenia leku są znacznie mniejsze od stężeń terapeutycznych (brak efektu terapeutycznego po podaniu standardowej dawki). Dzięki badaniom farmakogenetycznym możliwe stało się wyjaśnienie, dlaczego u niektórych osób ta sama dawka leku jest mniej skuteczna, a u innych wywołuje działania niepożądane. Ma to istotne znaczenie dla pacjentów przyjmujących leki o wąskim współczynniku terapeutycznym. Leczenie pacjentów z tą samą chorobą, tym samym lekiem „pasującym” dla wszystkich, podawanym w standardowej dawce, jednakowej dla wszystkich, nie zawsze jest skuteczne i bezpieczne. Należy pamiętać, że w każdej populacji może znaleźć się osoba, która inaczej zareaguje na podjętą farmakoterapię.

 

Ryc. 4. Odmienne reakcje chorych na leki.

 

Badania nad genomem człowieka prowadzone bardzo intensywnie w ostatniej dekadzie wykazały, że polimorfizm genetyczny dotyczy nie tylko genów kodujących enzymy metabolizujące leki, ale również genów kodujących białka biorące udział w mechanizmach działania leków (receptory, kanały jonowe, przekaźniki wewnątrzkomórkowe) i transporterów dla leków (np. MDR1-gen kodujący glikoproteinę P). Stosunkowo najlepiej poznano polimorfizm genetyczny enzymów metabolizujących leki. Najnowsze kierunki badań farmakogenetycznych skupione są na poszukiwaniu zmian w genach kodujących transportery i receptory dla leków.

Najważniejsze kierunki badań farmakogenetycznych

 

 

Ryc. 5. Kierunki badań farmakogenetycznych.

 

Genetyczny polimorfizm enzymów metabolizujących leki, transporterów oraz receptorów dla leków jest spowodowany dziedzicznie przekazywanymi (utrwalonymi) mutacjami w DNA. Do najczęściej występujących zmian mutacyjnych w genach kodujących te białka należą mutacje punktowe powstające w wyniku zamiany jednej pary zasad na drugą. Jest to tzw. polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP-single nucleotide polymorphism). Inne mogą polegać np. na wypadnięciu (delecji) pary zasad lub odwrotnie – na wstawieniu dodatkowej pary zasad (insercji). Tego typu mutacje występują znacznie rzadziej niż zmiany pojedynczych par zasad (SNPs). W wyjątkowych przypadkach można zaobserwować delecję całego genu (0 kopii aktywnego genu) lub zwielokrotnienie kopii genu (multiplikacja genu). Mutacje w składzie nukleotydowym DNA wywołują różne efekty fenotypowe i nie wszystkie mają znaczenie funkcjonalne. Powodują one np. zamianę jednego kodonu w drugi, który wyznacza inny aminokwas. Pojedyncza substytucja aminokwasowa w białku kodowanym przez gen, w którym zaszła mutacja punktowa, może całkowicie znosić aktywność enzymatyczną białka lub tylko ją modyfikować, zależnie od rodzaju substytucji aminokwasowej i jej położenia w peptydzie. Mutacje typu insercja-delecja mogą powodować odmienne właściwości białek kodowanych przez zmutowane geny, w wyniku przesunięcia ramki odczytu w trakcie translacji. Czasami duże zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA, jak np. długie delecje obejmujące liczne pary nukleotydów, całkowicie eliminują ekspresję różnych genów. Wykazano, że w genomie ludzkim występuje ponad 30 000 różych genów, co daje w sumie 3,12 biliona nukleotydów pojedynczych nukleotydów. Istnieją bazy danych, które gromadzą wiadomości na temat zmian wykrytych w DNA i je rejestrują. Najczęściej są to zamiany pojedynczych nukleotydów (SNPs). Do kwietnia 2001 roku liczba zarejestrowanych SNPs wynosiła 2 593 067.Większość z nich nie ma znaczenia funkcjonalnego, gdyż występują w regionach nie kodujących (intronach) genów. Przyjmuje się, że tylko 50 000-10 000 SNPs powoduje zamianę aminokwasów w kodowanym białku i może mieć znaczenie funkcjonalne.

 

Ryc. 6. Polimorfizm genetyczny SNPs.

 

Polimorfizm genetyczny enzymów, białek transportujących leki przez błony biologiczne czy też receptorów w tkance docelowej dla leku, w istotny sposób może wpływać zarówno na procesy farmakokinetyczne (wchłanianie, dystrybucję, metabolizm, wydalanie), którym podlegają leki w organizmie, jak i na efekt farmakodynamiczny leku.

 

Ryc. 7. Genetyczny polimorfizm.

 

Pozwala to wyjaśnić osobnicze różnice w skuteczności i toksyczności podjętego leczenia. Czynniki genetyczne mogą być przyczyną zarówno braku efektu terapeutycznego, jak i nasilonych, często toksycznych działań niepożądanych. U osoby bardzo szybko metabolizującej, standardowe dawki są niewystarczające do uzyskania stężeń terapeutycznych. W sytuacji, gdy lek działa poprzez swój aktywny metabolit (proleki), u wolnego metabolizera lek może być nieskuteczny (np. kodeina). Oporność na leczenie niektórymi lekami obserwowano w przypadku polimorfizmu receptora dla danego leku (np. klozapina, salbutamol). Działania niepożądane najczęściej występują u osób z upośledzonym metabolizmem. Badania farmakogenetyczne lat 90-tych poświęcone były głównie wyjaśnieniu molekularnego podłoża polimorfizmu enzymów metabolizujących leki, co umożliwiło opracowanie testów diagnostycznych do fenotypowania i genotypowania pacjentów w kierunku aktywności badanego enzymu. Testy te mają na celu najczęściej wykrycie osobników z odmiennym typem metabolizowania danego leku. Fenotyp pacjenta określa się przez podanie testowej substancji, która jest substratem dla danego enzymu. Aktywność enzymu – i przez to fenotyp – oznacza się na podstawie stosunku stężenia substancji niezmienionej do jej metabolitu (metabolitów). Jest to tzw. współczynnik metaboliczny (MR, metabolit ratio). W zależności od wartości MR wyróżnia się w populacji co najmniej dwie fenotypowo odmienne grupy - osoby wolno i szybko metabolizujące, czyli tzw. wolnych i szybkich metabolizerów. Dzięki wprowadzeniu nowych technik biologii molekularnej stało się możliwe oznaczanie genotypu pacjenta. W celu oznaczenia genotypu pobiera się DNA pacjenta, najczęściej z leukocytów krwi lub komórek błony śluzowej jamy ustnej. Oznaczając fenotyp pacjenta (aktywność enzymu) należy pamiętać, że inne równocześnie podane leki o charakterze induktora lub inhibitora dla danego enzymu, w istotny sposób mogą wpływać na oznaczony fenotyp. Problem ten nie występuje podczas oznaczania genotypu.

 

 

Ryc. 8. Fenotypowanie i genotypowanie.

 

Postęp w zakresie badań farmakogenetycznych, a w szczególności w zakresie miniaturyzacji i automatyzacji umożliwił adaptację klasycznych metod analizy molekularnej do technologii macierzy DNA („DNA microarray” lub „DNA chips”). Technologia ta zapewnia szybką, jednoczasową, jakościową lub ilościową ocenę w zakresie DNA, RNA lub białek. Opracowywane „mikromacierze” farmakogenetyczne mogą być wykorzystane w optymalizacji farmakoterapii. Niestety, ze względu na trudności w interpretacji wyników (nawet kilka tysięcy SNPs u jednego pacjenta), mniejszej swoistości niż zastosowane klasyczne metody do oznaczania genotypu (np. PCR-RFLP - polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism), metoda ta jest obecnie rzadko wykorzystywana w praktyce, zwłaszcza w Polsce. Częściej technologię macierzy DNA stosuje się w badaniach przesiewowych poszukujących nowych mutacji i asocjacji genów.

 

Ryc. 9. Identyfikacja genotypów – mikromacierze DNA.